2022年5月アーカイブ
2022年5月24日 15:02 ( )アフリカ米について
米とは、世界のうちほとんどアジアのもので、極東の三角州の広大な地の農業であることを暗黙のうち認識されている。確かに人類2番目の主要作物はアジアからであり、その90%(27億人の主カロリー源)はそこで栽培されている。
しかし、米はアフリカのものでもある。少なくとも1500年の間、西部アフリカでは別の種が栽培されてきた。西アフリカ諸国のいくつかの国は、古代から他のアジア人と同じように米志向だった。しかし、それでもほとんど 他の誰もそれらの種については聞いたこともない。1
1世界の他の地域にも米の親戚はいる。 Oryza属は 最も古代の植物で、ずっと遠くにまで離れてしまう前にすべての大陸に広がることができた。その結果、さまざまなOryza属の種が南アメリカとオーストラリアを含む地球上の熱帯地域に張り巡らされた。しかしアジアの1種とアフリカの1種のみが家畜化(栽培)された。
アジアの米は非常に先進的で生産性が高く、よく知られているので、その素朴な親戚はアフリカ自体でさえ曖昧に追いやられてきた。今日、ほとんどの アフリカで栽培されている米はアジア種である。実は「 ニジェールのフックの偉大な赤米」は、重要性が急速に低下したため、面積がほとんどの場合 外国人親戚の畑の雑草用としてしか残っていない場所に追いやられた。すぐになくなるだろう。
このことは許されるべきではない。アフリカの米(Oriza glaberrima)には、長く注目に値する歴史がある。アジアの近種(Oryza sativa)に導入される前、それはいかなる組織化された遠征グループが西アフリカ世紀中に選択され、確立された。それはおそらく中央ニジェールの洪水流域で発生し、先史時代のアフリカ人はそれを西のセネガルに、南のギニア海岸に、そして東のチャド湖にまで運んだ。これらの新しいホームで、勤勉な人々はそれをさらに発展させた。
極東の対応者のように、アフリカの古代の稲作農家は 多くの種類の生息地に適した驚くべき範囲の栽培品種を選択した。彼らは「浮遊」品種を生み出した(水深部で成長する様に)。弱く、強く光周期敏感なタイプ( 異なる緯度と季節で生長する)、沼地と高地の栽培品種( それぞれ灌漑および天水条件下で生長する)、および早生および晩生タイプを生み出した。 そして、これらすべてのために、彼らはさまざまなシード特性を持つフォームを選択した。
アフリカでのコメ生産を拡大するための現代の取り組みは、 この先住民の遺産を無視して、アフリカの米はまだ西アフリカの特に遠隔地で栽培されている。そこでは、最近まで、その多くは 首長や宗教儀式のための特別な贅沢な食べ物として出された。しかし、今日では、 アフリカ米の実質的なスタンドを栽培することはほとんど無い。最も激しい耕作区域は、ナイジェリアのソコト氾濫原(氾濫原)の「水上フィールド」と マリのニジェール川の内陸デルタである。しかし、その作物も広く薄くだが、ガーナとトーゴの国境にまたがる丘同様、シエラレオネとその周辺地域にも広がる。
ある観点から、この先祖の食べ物を放棄する正当な理由があるようだ。ほとんどの地域で、農家は収穫量が増え、種子の地面への飛散が少ない外国の米を好む。その粒子はもろくなく、したがって粉砕が容易なので製粉業者はそれを好むのである。荷送人もそれを好む。彼らにとってアフリカ米にはそれがないので、少しの検討をする価値もほとんどなく 貿易商品とほとんどのタイプは肌が赤くしたがって バルクハンドリングで従来の米との混合に適していない。
しかし、これらはほぼ完全に商業的農業に関する懸念である。状況は全く異なり、そこでは米が局所的には大きく育ち、自給自足し、あるいは 特殊に用途される。そこでは、収穫、もろさ、色、または国際的な関心は重要ではない。確かに、小規模農家はしばしばアフリカ米を好む。彼らは穀物の味と香り、そしてその赤みがかった外観さえ好きである。彼らは植物は生産が簡単だと思っている:その乱暴な成長と広がるキャノピー(林冠)は雑草を抑えるのに役立ちそしてそれは一般的にそれ自体で土地の病気や害虫に抵抗性がある。また、一部の人々にとり 古代の穀物が使われない限り、伝統的な儀式は無意味となる。
さらに、これらは利点ではない。そのアジアのいとこ(アジア米)と比較して、 アフリカ米は、変動する水深、過剰な鉄分、低レベルの管理レベル、不毛の土壌、過酷な気候、および遅い植栽(西アフリカの不安定な気候ために大切な機能の降雨はしばしば遅い)に耐えるのに優れている。
数千年とまではいかなくても数百年の間、アフリカ米の「浮遊」バージョンは ニジェール川のほとり、特にここティンブクトゥとガオの間で栽培されている。ニジェールの農民がこの600kmのストレッチカウントに沿って、種を蒔いたところの堤防を溢れさせ、低地を氾濫させる。イネは上昇する洪水の中で深さ数メートルで生き残ることができる。 1970年代に干ばつがニジェールの流れを減少させたとき、完全な作物を植えることができず、100万人の命が危険にさらされた。 (J.Gallais。courtesy Flammarion et cie,Paris)
また、一般的な米よりも成熟度の早いタイプもある。食料の在庫が低くなったときに緊急時に植えると、これらは命を救うことができる。
見通し
この興味深いアフリカの作物に将来実際に何が起こるか 個々のイニシアチブに依存しており、それらのほとんどはアフリカ自体の内部にある。問題の一部は、その名声の欠如である。どこでも、消費者は加工アジア米という恋に落ちる。誰かがアフリカ米の加工製品(つまり、パーボイルド(浸漬,蒸し,乾燥))を作成した場合、それだけでそれを高い支持に戻すかもしれない。確かに、それは古代の歴史的遺産の特に興味深いグルメ食品になるかもしれない。
問題の一部はまた、供給不足である。したがって、そのような専門市場の開発が進むと、アフリカイネは商品作物として存続する可能性が高いだろう。 そこで選択と育種によりそのさまざまな品種は、ほぼ確実にほとんどのアジア米と競争するためにアフリカの場所で作られた。その証拠は、たとえば、ある特定の種類はすでにアジア米の生産性と一致しており、収量の数字では最高のアフリカ米と貧弱なアジア米との間でかなりのオーバーラップがある。これは、アジア米の改良に費やされた5、000年の激しい努力を考えると注目に値する。
地元の米が商品作物として繁栄しなくても、 西アフリカで自給作物としては継続する。しかしながら、これがさらに数十年の長引く衰退、または大規模な使用への科学者、管理者、その他の反応に依存して確実な復帰が起こるかどうかである。現在無視されているフォームの中でも、何か植物に提供できるものがあるか、ほんの少しのサポート、プロモーション、および実践的な研究が大きな改善に結びつくかも知れない。
粉々になり、われやすいという穀物の問題は、すでに西アフリカ全体に広がっていてこのタイプを注意深く精査し、間違いなく克服することができる。少額の賞金で、ほぼ一晩で適切な遺伝子型を生み出す可能性がある。同じことが白い表面のタイプでも起こる可能性があり、多くの人が今日のメインのタイプよりももっと見栄えの良いものを見つけるだろう。今でも、すべての品種が赤い肌になっているわけではない。 たとえば、ギニア、セネガル、ガンビアでは、白いタイプは すでに利用可能である。
アフリカ
誰も今後数十年間にこの作物で何が起こるかを確信することはできないが、その生産を倍増し、さまざまな技術的限界の克服をするための見通しは良好である。
米はジャワやアラビアからの航海者がマダガスカルや東アフリカ海岸から紹介した種類の米よりずっと前にアフリカで栽培されていた。 在来種米は最初にニジェールデルタ中央部で栽培され、その後、 ガンビア、カサマンス、ソコト盆地で栽培された。 アフリカ米はニジェールの氾濫原中央部、セネガルとシエラの間の沿岸地帯 レオーネ、ギニアの山岳地帯、ガーナとトーゴの国境で現在特に利用されている。主要な中心は、野生の形態の分布を示している。二次的中心は、栽培タイプの注目すべき配列が発生する場所である。 主米作地帯は、アフリカ米が最も栽培されている地域である。
今述べたようなテクニカルの改善は、それに確かな未来を与える可能性がある。現在は西アフリカでのみ知られているが、最終的には他の場所でも見つかるかもしれない。アフリカの少数の国だけがアジア米を栽培しているが、作付面積の観点から米は大陸で4番目に大きい穀物である(トウモロコシ、トウジンビエ(ヒエ)、 モロコシ)。そして人口増加、生活水準、都市化、海外旅行(新しい料理への関心を伴う) 料理)、そして簡単に調理できる食品の検索が増えるにつれ、需要は増え続ける。現在、西アフリカは世界のコメ輸出量の4分の1を輸入している。
湿気の多い場所
それに直面して、アフリカ米は湿気の多い低地中で、最大の不利な点にある。これはアジアの水稲を栽培する一等国であり、現在 その競争力は明らかにそれを選択の作物にする。また、このゾーンの農民や政府はしばしば灌漑施設に投資するが、それは彼らが最高の収穫量と最高の売り上げの作物を育てるための莫大な支出である。その結果、アフリカ米が最も急激に減少したのはこのゾーンである。
一方、ここでもアフリカ米にとり小さいけれど活気のある場所があるようだ。たとえばシエラレオネ南部での最近の調査では、 アジア米が優勢な場合でも、農家は依然として1つか2つの超高速「ハンガーブレイカー」としての伝統的なタイプを保持している。そして、景気後退やその他の要因によって引き起こされる季節、悪化する空腹に直面した多くの農民は、彼らがそのシードの源を見つけることができれば都合いいので、彼らが言う短期間のアフリカ米の品種に帰りたい。2
2 P.Richardsからの情報。詳細については、15ページのボックスを参照して欲しい。シエラレオネの2つの品種、ペンデとマラは、90〜110日以内に熟す。ペンデは、雑草を窒息させる能力でも評価される、分げつ性の強い品種です。
乾燥地帯
真に乾燥した地域はアフリカ米は適切な作物ではないが、適度に 散水地(たとえば、年間降水量が760
mm以上の場所)または 季節的に氾濫するサイトの見通しが良好のところなら良い。降水量がしばしば不安定な乾燥地では、いくつかの品種は彼らの主要なライバルのアジア米の10-20日前に成熟することが重要である。シエラレオネ北部では、たとえば、ここ数十年の雨季は突然、異常に早く終わった。この理由だけで、農家は彼らの土地の少なくとも一部でアフリカ米を栽培している。3 それで、彼らは収穫が保証される。
3 P.Richardsからの情報。
高地エリア
西アフリカの高地4ではこの種の米が依然として重要な穀物プロデューサーであり、それは自給作物として重要であり続けるであろう。高地用の品種は、焼畑農業に特に役立つ。 それらの根のシステムと土壌伝染病に対する感受性は、主要作物のそれとは異なる。植付シーズンかそこらの間にサイトを「消毒」する傾向がある。
4 ほとんどの基準では、これらの土地はそれほど高くはなく、海抜レベル約1,000mにすぎない。
その他の地域
アフリカ以外の土地については、見通しはわずかしかない。そこでは、アジアの種よりも、利益が生じうまく適応する可能性はないのでアフリカ米はほとんど提供されない。5 小さな特殊作物としての将来、特に水田ではそれは呪われた雑草になる可能性が高い。
5たとえば、アフリカ米が国際的にあまり知られていない理由の1つは、世界有数のコメ研究施設があるフィリピンでの成長が鈍い。 これは劣等感の尺度ではなく、地域の状況、特にウイルス性疾患への適応の欠如からくる。
使用法
アフリカ米はアジア米と同じ目的で使用できる。したがって、それは非常に用途が広い。ただし、いくつかの特殊なローカル用途がある。たとえば西アフリカのマンディンゴとスーの人々は、米粉と蜂蜜を使って 儀式の目玉となるほどの特別な、甘い味わいのパンを作る。ライスビールは西アフリカ全体で人気があり、ナイジェリアでは特別なビールがある (betsoまたはbuzaと呼ばれる)。これらは米と蜂蜜から作られている。また、コートジボワールには 離乳食の成分としてアフリカ米を使用するプロジェクトがある。
栄養
どちらの米も主に炭水化物源である。ただし、実際には アフリカ米の栄養価はアジア米よりも優れている6。
6ガーナの食品研究所の食品栄養委員会からの情報。
固有の違いのためではなく、 研磨の違いである。アジアの米は常により高度に磨かれているため、 その栄養素(特に重要なビタミン、チアミン)は失われている。
農学
アジア米と同様に、アフリカ米は3つの主要な方法で栽培されています: 乾燥地(あるいは高地)、水田、および「フローティング」である。
乾燥地
アフリカ15の主要コメ生産国におけるコメ生産の約40パーセントは、唯一の水源として雨に依存している。そのエリアのほぼすべて アジアの種を採用しているが、まだ西アフリカでは乾燥地のアフリカ米の量は小さいが顕著な成長を遂げている。確かに、ガーナとトーゴの特定の地域では主食になっている。
乾燥地の形態は、雨季が少なくとも4か月、最小降雨量は760mmがどこであろうとも、明るい土壌で繁栄する。そこではしばしばキビ、トウモロコシ、ソルガム、ベニス、ロゼル、ササゲ、キャッサバ、または綿が間作される。今日の 品種は90-170日で成熟する。収量は1ヘクタールあたり平均450〜900 kgだが、 1ヘクタールあたり1,680kgにもなる。
水田
アフリカの米の約6分の1だけが灌漑され、その60%はマダガスカルという1つの国だけが使用して生産されている。しかし、水耕用稲(水田)は ガンビア- ビサウ、ギニア、シエラレのかつてのマングローブ地域でますます栽培されている。本質的に現在のすべてはアジア種である。
アフリカ米も同じように栽培できる。湿った場所に播種することができ、または水中の畑に移植できる。これらのタイプは140〜220日で成熟する。 収量は1ヘクタールあたり1,000〜3,000kgの範囲である。7
7ティンブクトゥの地域では、リズコベと呼ばれる非常に有望で浮遊しないドワーフタイプが 雨季の流出水で育った。(W. Schreursからの情報。)
フローティング
マリのニジェール川の内陸デルタでは、農民はさまざまな形態の 浮かぶアフリカ米を育種する。これらの植物は水の表面に頭を維持するために途方もなく長くなり、花が咲き、種をつける。あるタイプ(Songhai tomo)は3m以上の深さの水中で成長することができる。
浮遊品種は、他に何もできない深く浸水した盆地を利用することができる。それらはしばしばカヌーで収穫される。それらは180-250日で熟す。 収量は、成長期の初期の降雨量とその後の最終的な洪水の深さにより、1ヘクタールあたり1,000〜3,000kgの範囲である。
収穫と取り扱い
アフリカ米は、より有名なアジアの親戚の米のように扱われるが、(前述のように) 粒子は裂ける傾向があるので、より注意を払う必要がある。また、脱皮するのはもっと難しい。
そのような無視された作物で予想されるように、収量は変動し、 不確かである。ただし、それらは一般に言われるほどそれほど低くはないという連絡がある。
たとえば、次のコートジボワールの2つのサイトでの5年間の実験は、アフリカ米の16の個体群( 生産性)はアジア米の上位3品種と比べて遜色ない。にもかかわらず それらの自然な生育と自発的な粉砕、最高のアフリカ米の品種 (BG141およびBG187)は、平均で非常に安定した1,500〜1,800の収量を示し、アジアの対応物(モロベレカン)、コートジボワールで宣伝されている伝統的な高地の品種、8と同様の1ヘクタールあたりのkg(サイトによって異なる)を与えるものである。
8Clement and
Goli,1987.殆どの場合、Guinea-Bussauからのアフリカ米品種は他の品種のものより高収量を与える。
シエラレオネの米;
最近、研究者はシエラレオーネにおける米の分布と使用を調査した。以下は彼らの調査結果の説明である。それはおそらく 西アフリカの多くの地域の状況を示すものである。
シエラレオネのすべての地域で500を超える農家を訪問したところ、 245種類(「品種」)の米が使用されていた。これらのうち、24種はアフリカ米だった。
一般的にアジア米よりも収穫量は少ないが、アフリカ米は生き残り--そして、特に一部の地域では、特に北西の乾燥地域でささやかな復活を遂げている可能性がある。これにはいくつかの理由がある。アジア米と比較して、アフリカ米:
•極端に貧しい土壌でもうまく管理できるようである。
•雑草との競争力が向上する。確かに、農民は労働力不足のため作物を放りっぱなしにする。アフリカ米は アジアの米が雑草によって存在しえなくなったところでさえ多少収穫できる。 小規模稲作農家にとって労働力不足は 最も差し迫った制約である。
•より早く成熟する。私たちが収集したほぼすべてのサンプルは、100〜125日で成熟したので、国で最も早く成熟するイネ品種の1つである。 (私たちのサンプルの乾燥地アジア米の平均は130-140でした 日、湿地用の場合は160〜170日。)
•多くの人に好まれている。何人かの情報提供者は アフリカ米は栄養的に優れていると信じている。彼らはそれが「 胃」には重たく平均的なアジア米よりずっと長く空腹を寄せ付けない。
また、彼らはしばしばそれがよりうまみのある味わいであると私たちに言った。そして、彼らはそれが調理後もよく保たれると言った。これは特に 多くの人が1日1回しか食事を準備しないので重要だが 家族のメンバーはいつも食事をするために立ち寄る。
ただし、シエラレオネ北西部ではアジア米が好まれる。この地域では、人々はアフリカ米は殻をむくのが難しく、掃除が難しいと不満を漏らしていた その丈夫な赤いふすまを除くのに多くの作業が必要になる。特にそれが課す余分な作業負荷に女性は不平を言った。
一方、国内の他の地域では、赤は重要なメリットである。例えば、南と東のメンデ人は(不完全に粉砕された穀物に見られる)赤みが外国の米ではない保証とみている。パーム油に浸した米が儀式の一部として大きな役割を果たすが、そこでアジアの湿地品種を使用することは考えられない。
彼らの分野では、シエラレオネの農民はアジア米とアフリカ米を区別していない。両方の種は同じ名前でゆく:mba(メンデ)またはpa (テムネ)である。遺伝的観点から、フィールドは非常に混乱している。農民は一見それを好み、彼らのほとんどは望ましくないタイプを排斥する方法を知っていて彼らは望んで意図的に多様性を育てている。多くの場所でアフリカとアジアの種が交配されているように見えることに気づいた。最も人気のあるテムネ米の多くは、例えば、実際には中間タイプである(小舌の形、穀物の形、穂型によって判断される)。特定の名前の付いた在来種はどちらもアジア米でもアフリカ米でもなく、いずれかまたは両方の種に割り当てられる。 Paul Richards, Serrie Kamara,
Osman Bah, Joseph Amara, Malcolm Jusu
制限
現在の状態では、アフリカ米には確かに限界がある。 以下の通り:
•倒伏。植物は茎が弱く、季節の終わりに暴風雨が発生する傾向があり、時々それらを倒すことがある。
•脱粒。今日の植物は、成熟するにつれて種子を落とす傾向がある。
•分割。乱暴に扱うと種子が半分に割れる傾向がある。
• 色。穀物自体は常に白だが、ほとんどの種類の殻は赤である。
•処理。殻を取り除くのは骨の折れる作業である。
•雑草。西アフリカでは、アフリカ米の野生種および栽培種族間で広範な遺伝的相互作用が起こった。構築する混合集団は非常に複雑になる可能性がある。その結果、雑草は田んぼに蔓延し、 深刻になる可能性がある。9
9野生種と栽培種の間のこのような遺伝子流動は、作物にとり長期的に有益である。それは幅広い遺伝的基盤を維持し、干ばつ、害虫、 病気、およびその他の危険性に帯する抵抗性を強める。しかし、高収量の単一種穀物の必要性に直面している農民にとって、それは呪縛の可能性がある。
•病気。アジア米と比較したとき、寄生植物のストライガと原因不明の茶色の斑点にかかりやすい可能性同様、多くのカビに影響受けやすい。
これらの制限はまとめて恐ろしい組み合わせになりますが、 それらは主にこの作物が苦しんできた点の無視からきている。すべてがアフリカ米を栽培して使用する人々により回避されてきた問題である;研究はそれらを完全に克服しないまでも間違いなくそれらを減らすことができる。さらに、これらの制限のいくつかは 競合する穀物の特徴でもある。
次のステップ
アフリカ米は作物からなくしてしまわないようにする必要がある。それは研究、 開発、より大きなプロモーション、およびサポートに値する。少なくともそれは世界で2番目に大きい食用作物でありその近縁の潜在的価値の遺伝子を持っている。取られるべき行動には以下を含む:
アフリカ米の友達
プロとアマチュア両方のボランティアの組織によって、この数千年前のリソースのサンプルを保護、促進、提供を協力的な精神で一緒に探求する良いスタートを切ることができる。彼らもまた死ぬ前に、さまざまなタイプに付属する伝説を収集するかもしれない。
情報交換
研究者たちは現在、セネガル、マリ、ガーナ、コートジボワール、 ブルキナファソ、カメルーン、リベリア、ナイジェリア、シエラレオネ、およびその他の国々で米の研究している。1つの国際センターである西アフリカ稲開発協会はその作物を専門にしている。そして2つのフランスの研究所、Office de la Recherche
Scientifique et 技術アウトレマー(ORSTOM)およびInstitut de Recherches
Agronomiques Tropicalesetdes Cultures Vivrières-CentredeCoopération Internationaleen
Recherche Agronomique pourleDéveloppement(IRAT-CIRAD)も又アフリカ米のプログラムを担当している。これらの組織の1つを除くすべてはほぼ独占的にアジア米に取り組んでいるが、それらの専門知識の存在はアフリカの関連の発展を促進する良い機会でもあることを意味する。10
10これらおよびその他のプログラムの研究連絡先は付録Gに記載されてある。
国際的な科学コミュニティ内の刺激的関心の1つは、アフリカ米の利用可能な研究データーすべてのものを収集し、詳細なモノグラフを公開することである。
食品加工
先に述べたように、アフリカ米の調理済み製品の入手可能性の衰退を食い止め、実際、それを好転させるために多くのことをするかもしれない。革新、 創意工夫とマーケティングスキルを使用して、この食品を出色のものとする。それは、特別な製品として始まり、プレミアムで観光客やアフリカの伝統に捧げられた人々のためのホテルで販売される可能性がある。
シード供給
多くの地域では、循環している種子の量が非常に少ないため、 実行不可能な種にしている。種子の供給を維持することが重要である。次に、少なくともアフリカ米を栽培し続けたい農家は、どうやら現在シエラレオネで起こっているようには排除されない。
遺伝資源
アフリカ米のサンプルは、さまざまな組織によって収集されている。 特に、International
Plant Genetic Resources Institute(IPGRI)、ORSTOM、 およびIRAT-CIRADである。これは保存の目的で保管されており、可能な植物育種である。11
11野生および栽培アフリカ米の種子の約4,000サンプルのコレクションは、アフリカで古くから栽培されているアジア米の在来種同様ORSTOMおよびIRAT-CIRADで保持されている。これは、12のアフリカ諸国での14の収集特命の結果である。85パーセントは耕作された在来種(アフリカとアジアの両方)で、 15 パーセントは野生のアフリカ種である。
しかし、それでも多くの興味深いタイプは間違いなく西アフリカの広大な地域全体に収集されて残っている。
農学研究
この作物に関する確かなデータはほとんど存在しないため、多くの課題に取り組む農学の学生に取り有益なものは「地図に記入する」という挑戦である。例 以下のものが含まれる:
•粉々に粉砕しない遺伝子型を選択するか、それを克服するための技術開発の選択をする。
•耐塩性について株をテストする。
•干ばつ回避のためのタイプの特定。
•細胞樹液の浸透圧調整を測定する。
•プラントのストレージ容量と休止状態の要件をテストする。
•失われる穀物を減らす。アジア米の特定の株もこの問題に苦しんでいて、最近の研究は十分な窒素肥料を提供してそれを大幅に克服することを示している。12
12この調査は、USDA-ARS米生産および雑草のRobertH.Dilday コントロールリサーチユニット、P.O. Box 287、Stuttgart、Arkansas 72160、USAによって行われた。
•深水米の研究は不可欠であり、長い間放置されている。利用可能なリソース -気候、水、および成長地域-を適切な研究にとともに考えると、ニジェールの内陸デルタではおそらく深水米の生産量は3倍になる可能性がある。最も必要としているアフリカ地域の飢餓を減らすことに向けてヘルプのできる研究分野の1つである。
遺伝的改善
現在のアフリカのタイプはアジアのものよりも容易に穀物を落とすが、 いくつかの改良したものが乾燥地の品種で育っている。種子の粉砕を強調する追加研究は大きな違いを生む可能性がある。なぜなら 非粉砕の遺伝子は劣性であるため、非粉砕タイプの選択は迅速で、真の繁殖は即時でなければならない。その他の改善には、 病気への抵抗のための選択がある。この耐性はさまざまな遺伝子型に存在し、 そして大きな問題は、アジア米がさらに広がってもこれらの地元のタイプは失われないことである。高地では、どんな形のイネも爆風や鞘枯れに耐えなければならない。全て タイプはまた、イネ黄斑ウイルスに耐性がなければならない;いくつかの地元の栽培品種はすでにそうしている。
季節的な洪水に依存する地域では、品種は倒伏に抵抗し、肥料に反応しなければならず;移植の種類によっては、さまざまな期間苗床の成長(農民が予測不可能な自然の冠水の始まりを待っている間)に耐える必要がある。
研究者たちは現在、アフリカ米とアジア米両方の染色体を「マッピング」しており、植物のさまざまな特徴を制御する部分を特定する。13
13 G.Secondからの情報
この強力で現代的な技術は、 アフリカ米の遺伝的改良をjumpstart (復活)させるだろう。おそらくそれは2つの間の有用な遺伝物質の転送を容易にすることができる。
種情報
植物名
Oryza
glaberrima Steudel
シノニム (同意語)
Oryza barthii ssp。アフリカ米
一般名
英語:アフリカ米、glaberrima米
フランス語:riz
pluvial africain、vieux
riz、riz
africain、riz
flottant
カメルーン:erisi(Banyong)
ギニア:バガマレ、マレ、リズデバガ
マリ:イッサモ(river rice)、mou-bér(great rice)
シエラレオネ:kebelei、mba、mbei(メンデ)、mala(キッシ)、Kono、pa(テムネ)
説明
アフリカ米は、一般的に66〜120cmで育つ一年生の草である。 その高さは非常にいろいろである。乾燥地タイプは、滑らかでシンプルな稈があり、 下の節で根を形成し、穂(花房)まで単純に分岐する。フローティングタイプは、上位ノードでブランチやルートを形成する。 穂は堅く、滑らかで、コンパクトである。花は自家受精する; ただし、種間および種内の他家受粉が発生する。
遠くから見ると、アジア米とアフリカ米は見た目が似ている。 しかし、アフリカ米には小さな小枝がある( それが茎に結合する葉の基部に見られる小さな薄い膜)。そのコンパクトな穂には分岐は少ない。その小穂にはlawnsがない。それは完全に毎年であり、シードのセット後に死ぬ。一方、アジア米は成長を続けているため、シーズン後半には 2つは著しく異なって見えることがある。
分布
アフリカ米は主に西アフリカの南西部全域で重要だが、チャド湖のはるか東、特にニジェール、ボルタ、および他の川によって季節的に氾濫するサヘルの陸地で見つけることができる。 それは明らかにインドに導入された。また、それは17世紀のポルトガルの探検家によりブラジルにもって行かれた可能性がある。どういうわけかそれもエルサルバドルとコスタリカにも到達した。14
14 1950年代に、フランスの植物学者であるRoland
Porteresによって収集された。 彼は西アフリカの植物の研究を専門とし、 世界の注目を集めるアフリカ米紹介のパイオニアである。
栽培品種
アフリカ米の多くの栽培品種は、自然交配によって得られており、 近親交配、コンパクトな穂と重い穀物の形を与える。特に、さまざまな土壌や排水に適した沼地条件の種類がたくさんある 15。
15ある研究者P.マーティンは1976年、内陸のニジェールデルタで約180品種を収集した。マリ(ペリオデ)の生産における条件の改善 19631-973)。 L'Agronomie Tropicale 31(2):194-201。
マリ北部だけでも、浮かぶタイプ約30品種が見られる。16
16 W.Schreursからの情報。
アフリカ米の高地品種の例は、ITA
208、IRAT
112、 ミュータント18、IRAT 104、およびISA 6。17
17 J.Ayuk-Takenからの情報。
アッパーガンビア、ギニア、セネガル(カサマンス)では特別なものを見つけることができ、それは劣性遺伝が強化されたアフリカ米遺伝子型の特別グループで、白い殻、成熟するまで続く小穂、および アントシアニンを含まない植物性および花性器官である。これらは 多様性の二次領域であり、特に貴重な遺伝資源である可能性がある。
アフリカ米はハイテクに行くことができるか?
世界のコメ研究は圧倒的にアジア米に焦点を当てているが、 研究所から現在出現している目覚ましい発展は、アフリカ米での大きな進歩である。以下はその例である。
遺伝子マッピング。分子生物学者は最近、 特定の遺伝的属性の遺伝子が存在するイネ染色体上に位置をマークした。これらのマーカーは、これらの形質の遺伝子を追跡するために使用できる。 サンプル中に目的の遺伝子が存在するかどうかを判断する能力に巨大な力を授ける。たとえば、野生種と栽培種の遺伝子の目的の場所を見つけるのに役立つこと、遺伝子の外向きの効果が隠されている与えられた植物の「隠された」遺伝子を見つけることができること、何か以前は退屈な努力の生涯を要する可能性があった非常に何千もの交雑種の標本の分類を簡素化できることであった。
制限酵素断片長多型に基づく遺伝子マーカー(RFLP)は、アジアとアフリカの両方の米のために開発されている。たとえば、1988年に、コーネル大学のチームが(両方の種で)遺伝子の特徴すべてを運ぶ12番染色体のセットのさまざまな特性のマーカーを見つけた。その最初の地図には135の遺伝的ランドマークがあった;後に バージョンには300以上あった。
この新しいネットワークの特別な強みは、ブリーダーが非常に若い苗で今や働くことができるということである。言い換えれば、植物が成熟するのを何ヶ月もかかるのを待たずに彼らは特定の遺伝子が存在するかどうかを知ることができる。これは新しい品種(通常は10〜12シーズン)を育てるのに必要な時間を半分にカットできる。
アフリカとアジアの両方のゲノム(染色体セット)がマッピングされており、 残りの努力はこれまでのところ専らアジア米に使われた。それにもかかわらず、アジア米からのほとんどの結果は簡単に譲渡可能なりそうである。ゲノムは比較的小さく、トウモロコシの10分の1のDNAしか含まれていない。
試験管複製。最近まで草類の組織培養を使用してクローン化はなかったが、今日ではアジア米、トウモロコシ、ソルガム、ベチバー(ウサル) で行った。アフリカ米はこれまで試験管で栽培されてないが しかし、新しい洞察を考えると、この強力な候補になる可能性が高いようである。
いくつかのチームは、壁が取り除かれた細胞、プロトプラストから肥沃なイネを再生することに成功した。これはイネの遺伝子をいじるのはさらに簡単です。すでに、バクテリアからのDNAは イネのプロトプラストに移された。これらから育てられた成熟した植物 プロトプラストは、移植されたDNAを子孫に伝達した。
高リジンフォーム。
1990年代初頭、米国農務省 研究者は、高タンパク質品質と高タンパク質レベルの両方のアジア米の植物を発見した。これは非常に栄養価の高い品種への初めて栽培する期待を高めた。
これらの新しいフォームを見つけるために、Gideon W. Schaeffer、Francis T. Sharpe、Jr.、 John
Dudleyは実験室の皿の中に米細胞の小さな塊に致死量のリジンを与えた (健康のために不可欠なアミノ酸)。ごく一部のみ 処理を生き延びた。しかし、これらの少数の細胞は、正常よりより多くのリジンを許容する可能性があつた。科学者たちはそれらを全米植物体で育て、そして、得られた高リジン植物が真の遺伝子変異体であり、 したがって、新しい商用品種の繁殖に適していた。いくつかの交雑種は、ほぼ正常な重さの種子、良好な稔性を生産することに成功し栄養価が大幅に向上していた。
高リジン形質は明らかに単一の劣性遺伝によって制御されている。科学者たちは、この遺伝子を遺伝子工学者が世界のアジアの米作物に組み込めるように提供、分離し始めた。 その成果は、多分高リジン形態をアフリカの種にも作成するため簡単に転送できる可能性がある。
ハイブリッド。米の花の雄しべと雌しべの両方の部分は通常です稔性ですが、米国農務省の研究者J. Neil Rutger 15時間の日光の下で特定のイネを育てることは本質的に雌しべを作ることを発見した。植物は決して花粉稔性を発達させない。これは米の収量を現在よりもはるかに高いレベルに引き上げ、安価で簡単な方法を提供するかもしれない。改変された植物は受粉できないので、 他の植物による受粉のために既製する。したがって、どんな受粉も雑種を生産し、これは、堅牢で高収量を生み出すことがよく知られている。このプロセスはアフリカ米ではまだテストされてないが、 ラトガーはそれがうまくいくかもしれないと信じている。
Asafハイブリッド。ここ数十年で数十の研究が行われアジア米とアフリカ米との交配の遺伝的および形態学的結果に関する論文がある。ほとんどが日本、台湾、および 中国である。それらの背後にある原動力は、 ハイブリッドを形成することによるアジア米の収量の増加である。
少なくとも原則として、アフリカ米とアジア米の交配は いずれかまたは両方の歩留まりを向上させる。植物学の文献はそれらの非互換性を強調していますが、2つは遺伝的に近い。どちらも自家受粉です二倍体(2n = 24)であり、同じゲノムを持っており 稲の遺伝学者はAAと呼ぶ。
環境要件
日長
品種に応じて、ニュートラルから強い感度まで変化する。でも、 現在使用されているほとんどの乾燥地タイプは、光周期に敏感である。それらは乾季が到来し花を咲かせる。一方、ほとんどのフローティングタイプ(少なくとも マリ北部)は、日長に対してほとんど感度を示さない。
降雨
一部の高地の品種は、降水量が少なくても約700mmで十分に生産できる。
高度
海面から1,700メートルまで。
低温
約25°C未満の平均気温は成長を遅らせ、収量を減らす。 約20°C未満では、これらの影響が顕著になる。
高温
アフリカ米は30°C以上の温度でうまくゆく。約35°C以上では、 しかし、小穂の出生力は著しく低下する。
土壌タイプ
いくつかの栽培品種は、アルカリ性の場所でアジア米よりも優れているようだ。 リンが不足している場所でも同様である。当然のことながら、しかし、作物は沖積土壌で最高のパフォーマンスを発揮する。
関連種
アフリカ米の近親のもののうち少なくとも2種は定期的に食料用に集められ、多くの場合、市場に登場するのに十分量である。
Orza barthii(Oryza breviligulata)18は、 モーリタニアからタンザニア、そしてスーダンからボツワナの季節的な浸水地域に見られる。アフリカ米栽培の野生の祖先である。
18アフリカの野生米の命名法は非常に混乱している。名前 Oryzastapfii、Oryza breviligulata、およびOryza
barthiiは、使用法が不確かな場合によく発生する。多くの 古い文献はこれによって役に立たなくなる。現在、Oryzabarthiiは Oryzaglaberrimaの直接の祖先と考えられている。 Oryza breviligulataという名前が現在無効と考慮されており、 Oryza stapfiiは、以前はアフリカイネの雑草の種族に付けられていた名前である。
それは浸水地域に牧草地を形成することができる。その穀物はとても簡単に落ちるので 手作業で注意深く収集する必要がある。 (人々はバスケットまたはひょうたんを使用し、そして 時々彼らは収穫を容易にするために結び目で茎を結ぶ。)それはおいしく市場で販売されることもある。しかし、米が栽培されているところならどこでも、この植物は 主に根絶される雑草と見なされる。この種の特定の株は イネのバクテリア枯病(Xanthomonas)に免疫があり、 遺伝資源としての貴重な未来を与える。19
19 S. Devadath 1983年。イネのバクテリア枯病に耐性のあるアフリカのワイルドライスであるOryza barthiiの株。 Current Science(Bangalore)52(1):27-28。
Oryza longistaminataは、ナミビアとトランスバール、そしてマダガスカルまで南にあるアフリカ熱帯地方全体で見られる一般的なワイルドライスである。他の種は異なり、それは根茎を持つ多年生植物である。それは背が高く、異系交配である。それは通常 小川や排水路で育ち、根から繁殖し,時に僅かに種子を巻く。それにもかかわらず、これらの貧弱な穀物は不足の時に求められる。
セリアック病(CD)の将来の研究テーマ
集中的な学際的研究は、過去数十年にわたってセリアック病(CD)の複雑な特徴を理解する上で実質的な進歩に貢献してきた。ただし、多くの質問は未解決のままであり、将来の研究で対処する必要がある。
定義
定義に関して、科学文献は、「セリアック病」およびトリガー因子「グルテンタンパク質」に関連する用語の使用に関するコンセンサスの欠如に苦しんできた。CDに関係するすべての人が同じ用語を使用することを保証するために、「オスロの定義」や「NICEガイダンス」などの対応する取り組みを継続することが望ましい。見方によっては、CDは一部は食物過敏症として、また一部は自己免疫疾患として認識されている。両方の側面を含む妥協案として、CDは自己免疫成分を伴う免疫介在性食物不耐性として定義される可能性がある。
1. 複雑な病気セリアック病
疫学
CDの有病率に関する多くの疫学研究が発表されているが、診断ツールや参加者の数が異なるため、比較が難しいことがよくある。場合によっては、まったく異なる定義を持つ2つの用語の有病率と発生率が混ざり合ったり、同じ意味で使用されたりする。有病率の決定基準の標準化と、アクティブ、サイレント、および潜在的なCDのケースへの区別は、より正確な疫学的画像を確立するのに役立つ。 CDの認識の欠如と疑惑の低さのために、CDの有病率は発展途上国で過小評価されている可能性が最も高い。有病率、臨床経過、治療の有効性、患者のコンプライアンス、および疾患の合併症に関する前向き研究は、医師のより良い教育、リスクのあるグループでのスクリーニング、および開発途上国でのグルテンフリー製品の入手可能性の改善とともに必要である。血族関係の高い地域での研究は、CDの遺伝子型と表現型の相関関係を見つけ、特定の遺伝子マーカーを特定し、CDと他の自己免疫疾患との関連を明らかにするのに役立つ可能性がある。
遺伝学と環境要因
ヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子DQ2 / 8とCDの発生との強い関連性は、決定的に証明されている。しかし、これらの対立遺伝子はCDに対する遺伝的感受性の約40%しか説明していないため、CDに関連する非HLA遺伝子はまだそれらの同定を待っている。さらに、どの要因が病気を予防するかを解明するために、CDのないDQ2 / 8陽性の個人におけるグルテンペプチドへの反応を研究する必要がある。感受性変異体はジェノタイピングの進歩によって決定されているが、これらの変異体の機能的結果と疾患の病因へのそれぞれの寄与はまだ不明である。エピジェネティクス(メチル化、ヒストン修飾など)の役割は、これらの遺伝的変化がCD感受性に重要な役割を果たす可能性があるとしても、CDでは十分に研究されてない。ダウン症やターナー症候群などの他の遺伝病との関連によるCDの未知の遺伝的欠陥の発生は、まだ十分に調査されてない。最後に、臨床診療における遺伝子発見の適用可能性を評価する必要がある。遺伝的要因に加えて、感染症、帝王切開による出産、乳児への母乳育児の影響、乳児の食事へのグルテン導入のタイミング、衛生基準などの環境要因が、CDを誘発する潜在的な要因として議論されている。これらの関連性の強さを研究する必要があり、CDの予防の可能性についての推奨事項を提供する必要がある。共生および病原性微生物の変化が少なくとも部分的に原因であるか、むしろCDの結果であるかどうかについては、議論の余地がある。この難問の解決は、マイクロバイオームを調節するための可能な方法を探求する前に重要です。特に、ウイルスや真菌の役割は今のところ十分な注目を集めていない。CDの開発につながる遺伝的要因と環境要因の複雑な相互作用についてはほとんど知られておらず、それぞれの貢献を理解し、可能な予防戦略を開発することが主要な研究分野となるであろう。
臨床的特徴
今日、多くのCD患者は、主に腸外症状と非特異的所見を示すか、無症候性である。これは、医師の意識を高め、教育を改善することによってのみ克服できる正しい診断のためのかなりの課題を提起する。少数のCD患者も、吸収不良だけでは説明できない神経学的または精神医学的症状を示す。しかし、これらの関連する神経障害の根底にある正確なメカニズム、およびCDと統合失調症または自閉症との関係は不明である。 難治性腹腔疾患(RCD)IおよびIIの病因を解明する上で最近の進歩があったが、顕性リンパ腫の治療および予防のための新しい標的戦略を開発するために、より多くの研究が必要である。症状と非特異的所見は患者で類似している可能性があるため、CD、非セリアックグルテン過敏症(NCGS)、過敏性腸症候群(IBS)をより適切に診断できるようにするには、さらなる研究が必要である。患者は比較的貧弱な健康関連の生活の質に苦しんでいるため、IBS患者に対するルーチンのHLA遺伝子型決定の考えられる利点を評価する必要がある。現時点では、一般人口の有病率がCDの有病率よりもはるかに高いと推定されていることを除いて、NCGSの分野ではほとんど知られていない。現在、NCGSの血清学的マーカーやバイオマーカーはなく、診断は主にCD、小麦アレルギー、IBSを除外し、食事からグルテンを除去した後の症状の改善を監視することによって行われる。病態メカニズム、潜在的な遺伝的および環境的要因、および代替治療の選択肢と同様に、NCGSを引き起こす穀物成分はまだ特定されていない。「自己免疫成分(トランスグルタミナーゼ[TG]2)を伴う疾患として、CDは他の自己免疫疾患を伴う可能性があり、その逆もある。いくつかの共有遺伝子座が特定されているが、より良いリスク評価のためにはさらに多くの研究が必要である。別の自己免疫疾患を発症するリスクの低減に対するグルテンフリーダイエット(GFD)の効果については議論の余地がある。さまざまな自己免疫疾患の関連についての理解が深まると、予防戦略の開発が可能になる。 CDでは、外因性因子(グルテン)が自己抗体や組織破壊などの自己免疫機能の誘発につながる可能性がある。したがって、自己免疫疾患における適応免疫応答は、自己免疫プロセスの標的である抗原に向けられる必要がない場合がある。そのため、外因性の要因が他の自己免疫疾患の原因となる可能性がある。モデルとしてCDを使用して、これらの推定される外因性因子の存在を検証し、他の自己免疫プロセスを促進するためのそれらの相対的な寄与を評価する必要がある。
診断
診断 IgA
/ IgG TGA、IgA
/ IgG DGPA、IgG
AGA、およびIgA
EMAアッセイ用の臨床酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)キットの要件は、最大の感度と特異性である。これは1つのテストでは達成できないため、できるだけ多くの誤検知と誤検知を除外するために、テストの最適な組み合わせを決定する必要がある。臨床検査では、抗原の質やカットオフ値が異なるため、パフォーマンスが異なることがよくある。共同研究は、さまざまなテストキットで測定された結果の精度を評価するのに役立つ。新しい診断キットを評価するために、分析の特異性、感度、取り扱い、時間、およびコストのパフォーマンス基準も確立する必要がある。同様に、最近開発された免疫センサーの信頼性を判断する必要がある。
最新のESPGHANガイドラインでは、IgA TGA力価が正常値の上限の10倍を超えている場合、医師の裁量で小児の腸生検を省略できることが示唆されている。 力価レベルを含むこの勧告の影響は、将来監視する必要がある。 さらなる研究は、十二指腸生検が消耗する可能性のある症例を決定することに焦点を当てるべきである。 テンプレート病理報告と病理学者間のコミュニケーションを通じて、観察者間のばらつきを減らす。
消化器病専門医と臨床医は、軽度の粘膜損傷と、CDの非定型的な症状を含む組織病理学的変化の全範囲の認識を改善することができる。 比較的非侵襲的で安全な手順としてのビデオカプセル内視鏡検査(VCE)の使用は、現在、生検を取得できないこと、関心領域が見落とされる可能性、およびVCE画像の主観的で労働集約的な分析によって制限されている。 したがって、コンピュータ化された定量的画像処理は、VCE記録を分析するための強力なツールになる可能性がある。 CDの活動を検出、定量化、および監視するための他の非侵襲的な方法論を開発する必要がある。
病理メカニズム
大量のプロリンおよびグルタミン残基により、グルテンタンパク質およびペプチドは、胃、膵臓、および刷子縁酵素による切断に対してかなり耐性がある。小麦、ライ麦、大麦、またはオート麦製品を経口摂取した後、グルテンタンパク質は胃腸管でタンパク質分解されるが、腸のブラシボーダーに到達するグルテンペプチドの実際の構造と量に関する情報はない。次に、上皮バリアを通過するペプチドの通過は、経細胞経路または傍細胞経路のいずれかに従うが、いずれかの経路のそれぞれの寄与を明らかにする必要がある。経細胞経路が優勢であるように思われるが、エンドソーム/リソソームコンパートメントでのペプチド分解の速度に取り組んだ研究はほとんどない。密着結合のバリア機能は健康な人では無傷ですが、活動性CDの患者は、ゾヌリンのアップレギュレーションにより腸透過性の増加を示す。これが、グルテンペプチドが未修飾の固有層に到達する可能性がある理由である。しかし、この高い透過性がCDの原因なのか、それとも絨毛萎縮と炎症性サイトカインの分泌の結果なのかはまだ明らかではない。 適応免疫応答に関しては、細胞外環境へのTG2の分泌につながるカスケードは行われていない。しかし、この高い透過性がCDの原因なのか、それとも絨毛萎縮と炎症性サイトカインの分泌の結果なのかはまだ明らかではない。 獲得免疫応答に関しては、細胞外環境へのTG2の分泌につながるカスケードは特定されておらず、TG2の活性と炎症のどちらが先かという問題を解決する必要がある。 CD特異的抗体は、この疾患の重要なマーカーであり、血清学的検査に役立ちますが、CDの病因におけるそれらの役割はまだ明らかにされていない。 自然免疫応答に関しては、毒性ペプチドの作用機序を解明する必要がある。これまでのところ、グルテンペプチドの受容体は腸上皮細胞で同定されていない。さらに、CD患者の上皮におけるTCRγδ+上皮内リンパ球(IEL)の役割は、GFDで何年も経過した後もそのレベルが高いままであるため、議論されている。自然免疫応答の開始における、遺伝的および環境的要因、特にグルテンペプチドまたはアミラーゼトリプシン阻害剤(ATI)のような他の穀物成分のそれぞれの寄与を評価するために、さらなる研究も必要である。 適応免疫応答と自然免疫応答の両方がCDに関与していますが、それらの相互依存性はほとんど知られていない。適応免疫応答におけるグルテンペプチドの役割は十分に特徴付けられているが、自然免疫応答に関してはほとんど知られていない。自然免疫応答のメカニズムを解明することは、CDの病態メカニズム、CDにおける適応免疫応答との相互作用、および一般的な炎症反応と組織破壊反応の理解を深めるのに役立つ。これにより、予防戦略を設計し、代替治療法を開発するための新しい可能性が開かれる。
2. 穀物タンパク質
穀物の貯蔵タンパク質は、単一のタンパク質の非常に複雑な混合物で構成されている。これらの貯蔵タンパク質の多数の総アミノ酸配列は、配列決定技術によってDNAおよびRNAから翻訳され、データベースに入力された。ただし、多くのエントリはレビューされていないか不完全であるか、タンパク質の存在の証拠が不確実であるか、予測されているか、または相同性から推測されている。エントリのごく一部のみが、転写レベルまたは実際のタンパク質レベルでのタンパク質の存在の証拠を持っている。したがって、貯蔵タンパク質のアミノ酸配列を完成させるには、さらに多くの作業を行う必要がある。
セリアック病の毒性
実際の毒性試験の前に、試験に使用する材料を注意深く特性評価し、純度、タンパク質/ペプチド含有量、および組成について分析する必要がある。生体内検査は通常、穀物タンパク質のCD毒性を評価するための「ゴールドスタンダード」と見なされているが、必要なサンプル量が多く、CD患者の負担が大きいため、生体外検査に大きく取って代わられている。インビトロ試験は、CD患者の腸組織の器官培養または非常に頻繁に使用されるT細胞増殖アッセイを使用して行うことができる。グルテン感受性T細胞アッセイは、免疫原性効果のレベルを比較するために使用されてるが、T細胞検査によって測定された免疫原性は、invivoまたは臓器培養検査によって明らかにされた毒性に必ずしも対応していない。これが、確認方法として器官培養による毒性について免疫原性薬剤を試験することが興味深い理由である。器官培養の利点は、自然免疫と獲得免疫の両方のモデルであり、それらの相互依存性を研究するために使用できることである。動物モデルは、CDの病態メカニズムの新しい側面を理解するのに役立つが、現時点では、満足のいく動物モデルはない。トランスジェニックマウスを使用していくつかの有望な試みがなされましたが、病気のすべての側面を網羅するモデルを見つける必要がある。 1つの仮説は、2倍体または4倍体コムギの古代の株は、Dゲノムがないため、CD刺激エピトープが少ない可能性があるというものである。ただし、穀物種内のさまざまなレベルのCD毒性の実験的証拠はない。オーツ麦に関しては、2つの既知の免疫原性アベニンエピトープの含有量が品種間で異なるため、免疫原性に違いがある可能性がある。これらのエピトープを欠くオーツ麦品種を見つける可能性については議論の余地があるが、完全に安全なオーツ麦品種が存在する可能性がある。 CD患者が消費するオーツ麦にグルテン汚染がないことを保証する厳格な品質基準と同様に、GFDのオーツ麦の長期評価が依然として必要である。トウモロコシゼインの消化性トリプシン消化物の最近のインシリコ分析により、CD患者の非常に限られたサブグループに有害である可能性のあるいくつかの免疫反応性α-ゼインペプチドが得られた。免疫原性と毒性に関する包括的なinvivoおよびinvitro研究が欠落しているため、CD患者に対するトウモロコシの安全性を疑問視する前に注意を払う必要がある。 同様に穀物種のそれと同様に、異なるプロラミンまたはグルテリン画分および異なるタンパク質タイプのCD毒性のレベルを比較することはほぼ不可能である。調査の大部分はグリアジンを使用して実施されたが、他のタンパク質画分とタイプ、特にライ麦と大麦からのデータが欠落している。同様に、グルテンペプチドのCD毒性に関する研究は、ほとんどがα-グリアジン由来のペプチドに焦点を合わせている。 γ-およびω-グリアジン、グルテニン、セカリン、およびホルデインからの対応する配列は、器官培養または生体内チャレンジによってまだテストされていない。 ω-グリアジンを調べた場合、グルタミンとプロリンの含有量は大きく異なりますが、ほとんどの場合、ω5-グリアジンとω1,2-グリアジンの区別はなかった。
3. 従来の治療法
GFDは一般に、CD患者の死亡および悪性腫瘍のリスクの低下と関連しているが、一部の研究では矛盾する結果が見つかっているため、より長期的なモニタリングが必要である。診断されていないCDの場合の死亡、悪性腫瘍、骨粗鬆症、およびその他の状態のリスクの包括的で長期的な評価も利用できない。
現在、GFDはサイレントCDには推奨されているが、潜在的なCDには推奨されておらず、リスクのあるグループでのスクリーニングによって検出された無症候性CDには一貫性のない推奨が示されている。これらの推奨事項を再評価するには、リスクとメリットを慎重に比較検討するより長期的な研究が必要である。 GFDを実施している患者は、1日あたり20mg未満のグルテンを摂取することをお勧めするが、CDと比較した食事中のグルテンの真の安全な曝露しきい値は今後も定義する必要がある。診断後、合併症を防ぐためのフォローアップ管理のための標準的なガイダンスはない。別の生検を行う必要がある期間を定義し、この繰り返しの生検を省略して、血清学のみに基づいてモニタリングを行うことができるかどうかを定義することは有益である。特に、少数民族、青年、およびコンプライアンスが低い小児期に診断された成人の患者にとって、既存のリスクを低減するためのGFDへの食事順守の重要性についてのより良いコミュニケーションが不可欠である。GFDへのコンプライアンスを評価するための記述的な患者調査のような非侵襲的(患者を傷つけない)ツールとコンプライアンスを改善するための要因の特定が必要である。 GFDのCD患者の健康関連の生活の質(HRQOL)に関するさらなる調査も、HRQOLを改善する可能性のある要因を特定するために望ましいだろう。長期的な研究では、GFDが全体的な栄養状態、特にビタミンやミネラルの状態に及ぼす影響を監視し、サプリメントが必要かどうかについてのガイダンスを提供する必要がある。
代替療法
CD患者は、CDに対するワクチン、またはグルテンを含む食品を時折食べることができる錠剤を利用したいという希望を表明している。このような代替療法はまだ開発の初期段階にあり、有効な物質が市場に出る前に、安全性と毒物学に関する厳しい基準に準拠する必要がある。フェーズIIの臨床試験はすでに進行中ですが、フェーズIIIの試験は、CDの活動を監視し、患者に関連する結果を反映するための非侵襲的な方法論の欠如によって妨げられている。経口酵素療法に関しては、生体内で効果的に解毒できるグルテンの量を実験的に決定する必要がある。グルテンの量に影響を与える重要なパラメータは、酵素の投与量、利用可能な時間である。
グルテンの量に影響を与える重要なパラメーターは、酵素の投与量、グルテンが作用するのに利用できる時間、および他のタンパク質やその他の食品成分の存在である。主な用途は、GFDのグルテン汚染を解毒し、不注意によるグルテン摂取を防ぐことである。経口カプセルを介した食事ごとに1回の酵素送達の代替として、改善された投与スケジュールおよび送達経路を開発することができた。それぞれの治療オプションを適用した後、悪影響なしに許容できるグルテンの量は、すべての新しい治療アプローチについて回答する必要がある。
4.
グルテンフリーの原材料からの製品
グルテンフリー製品の市場は急速に成長しており、多くの製品が改良された処方で開発されている。しかし、グルテンフリー製品の香り、味、質感の質は、多くの場合、従来の製品よりも劣っている。特にグルテンフリーのパンやビールの製造では、風味と口当たりの向上が継続的な課題である。プロセスと配合を改善するためのさらなる可能性を探求する必要がある。
グルテンフリーでレンダリング(使用)された製品
グルテンフリーの小麦デンプンは、その好ましいテクスチャー特性のために、多くのヨーロッパ諸国でグルテンフリー食品の製造に使用されている。これらの国々では一般的に広く受け入れられており、小麦デンプンベースのGFDに対する食事の反応は、天然のGFDに対する反応と同じくらい良好であった。ただし、特に米国とカナダでは、CD患者に対する安全性について疑問が残り、長期的な影響に関するさらなる研究が推奨される。グルテン含有食品のペプチダーゼ処理は、グルテンを検出できないレベルに分解することに成功している。食品生産に適用する前に、この処理が成分に及ぼす機能的影響に対処し、最初の食品と比較する必要がある。グルテンが不足している株をもたらす小麦と大麦の遺伝子組み換えにより、これらの穀物のCD毒性が低下する可能性がある。しかし、このCD毒性の低下が、これらの株をCD患者にとって安全にするのに十分であるかどうかは明らかではない。他の未解決の質問は、経済性、そのような株から作られた製品の品質、遺伝子組み換えの安定性、そして消費者の受容です。
立法
世界的な移動と旅行により、グルテンフリー食品に関する規制がコーデックス委員会に基づいてすべての国で調和されていれば、CD患者にとってより簡単になるであろう。現在、オーストラリアとニュージーランドでは、ヨーロッパ、米国、カナダよりも厳しい基準がグルテンフリー製品に適用されている。その上、製品ラベルには多くの異なるグルテンフリーのシンボルがある。これらのいくつかは信頼できるグルテンフリーの認証機関によって割り当てられているが、他の製品はマーケティング目的の人目を引くシンボルであり、製品が本当にグルテンフリーで安全かどうかについての信頼できる情報を提供してない。統一された基準に基づいてメーカーと製品に割り当てられた普遍的なグルテンフリーのロゴは、グルテンフリーと表示された製品の安全性に関する混乱と懸念を防ぐ。
グルテン分析
多くのグルテンフリーと思われる食品のグルテン含有量を正確に測定することは、依然としてかなりの課題である。適切なサンプル準備は削除する必要がある」「グルテン分析多くのグルテンフリーと思われる食品のグルテン含有量を正確に測定することは、依然としてかなりの課題である。適切なサンプル前処理では、事前の熱処理、加水分解、または発酵とは関係なく、干渉物質を除去し、すべてのグルテンタンパク質またはペプチドをマトリックスから可溶化する必要がある。プロラミン分析と毒性に関するワーキンググループによって提供されたPWG-グリアジンを除いて、グルテンの一般的に受け入れられているレファレンス資料は今のところ利用できない。グルテンの標準物質を提供することは、さまざまなグルテン定量法の結果を評価、検証、および比較するために不可欠である。
ELISAのような免疫学的手法は広く使用されている高感度の方法ですが、レファレンス物質、抽出プロトコル、およびプロラミンにのみ特異的な抗体が異なるため、制限がある。新しいELISAは、すべてのCD毒性穀物からプロラミンとグルテリンの両方を同等の感度で検出できるはずである。免疫センサーは、従来のELISAの有望な代替手段となる可能性がありますが、最初にその性能を検証する必要がある。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ELISAを補完する高感度の非免疫学的手法として使用できる。特定の加工シリアル製品にはDNAが含まれていないため、将来、すべての食品および添加物に含まれるCD毒性シリアルの検出への適用が制限される可能性がある。質量分析は、グルテンタンパク質およびペプチドを高感度かつ正確に検出するための最も有望な非免疫学的アプローチである。重要な考慮事項は、関連するグルテンマーカーペプチドの選択、ペプチド含有量からグルテン含有量への変換、および可能な限り多くのタンパク質配列のバリエーションをカバーする信頼性の高いデータベースの確立である。 より多くの研究は、レファレンス資料の開発、タンパク質データベースの編集、分析方法の比較、およびグルテンの安全性を確保するためのグルテン定量のための正確で再現性のある一般的に適用可能なプロトコルを生成するためのさまざまなマトリックスの影響に焦点を当てる必要がある。
グルテンフリー製品について-3
4.
グルテン分析
分析手法は、世界中の食品品質の評価と維持に重要な役割を果たしている。特に、有毒化合物など、消費者の健康に影響を与える食品成分や添加物の正確な分析が不可欠である。ほとんどの有毒な食品成分は、アクリルアミドなどの単一の化合物またはマイコトキシンなどの化合物の小グループのいずれかである。それらの検出と定量化の方法は、それらの特別な構造に関連して決定することができる。ただし、CD(Celiac
disease)の場合、沈殿要因であるグルテンは、異なる構造を持つタンパク質の複雑な混合物である。グルテンの組成は、その植物起源(例、穀物種、品種)、植物が生産された農業条件(例、気候、土壌、施肥)、および食品加工手順(例、加熱、酵素分解)によって異なる 。さらに、グルテン中のタンパク質内の毒性エピトープに関する知識は不完全である。多くの研究所は、過去数十年にわたって正確なグルテン測定のための解決策を探してきたが、最終的な広く受け入れられている解決策に到達することはなかった。
1950年代以来、GFD(Gluten-free diet)の厳格な遵守がCDの不可欠な治療法であることが知られている。グルテンの1日摂取量は20mg未満である必要がある。小麦、ライ麦、大麦、オート麦のグルテンを含む食品はすべて避け、グルテンを含まない代替食品に置き換える必要がある。コーデックス委員会およびその他の国際機関および国内機関は、CD患者の特別な食事使用のための食品中のグルテンの許容レベルを規制している。 Codex Alimentariusによると、グルテンを含まない食事は20mgグルテン/ kgを超えてはならない。グルテン含有量を減らすために特別に加工された食品の場合、国レベルで100 mg / kgのしきい値を許可できる。
食品中のグルテンの検出と正確な定量は、CD患者だけでなく、グルテンフリー食品を製造する業界や食品管理にとっても不可欠である。適切なメソッドの最小要件には、十分な感度、選択性、およびキャリブレーション用の認定された標準物質が含まれている必要がある。さらに、それらは生の材料だけでなく、加工された材料(熱処理、発酵、酸処理)にも適用可能でなければならない。大事なことを言い忘れたが、それらは共同研究で評価され、商業的アッセイとして利用可能でなければならない。分析手順には、基本的に3つのステップが含まれる。
1.マトリックスからのグルテンタンパク質/ペプチドの完全な抽出。 2.キャリブレーションのための代表的なタンパク質/ペプチドリファレンスの適用。
3.抽出されたグルテンタンパク質/ペプチドの正確な定量。
グルテンの定量に関する数多くの研究が過去数十年の間に発表されている。初期の結果はDenery-Papiniとその同僚[94]によって要約され、Wieser [95]とHarasziと同僚[96]によるより最近の結果で完成した。免疫学的手法、特にELISAは、原材料や食品中のグルテンタンパク質やペプチドの分析に焦点を当ててきた。非免疫学的方法は、独立した制御方法と同様に重要である。代替技術として、ポリメラーゼ連鎖反応、質量分析、およびカラムクロマトグラフィーが提案されている。さらに、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析などのさまざまな分析手順が、CDの病態メカニズムの理解の進歩に決定的に貢献している。
4.1 タンパク質抽出
グルテン含有材料、原材料、食品は、多くの成分で構成されている。したがって、グルテン分析の最初のステップは、後続の定量方法とは関係なく、マトリックスからグルテンタンパク質を抽出することである。天然グルテンタンパク質は、水や塩溶液に溶けない。グルテンタンパク質の抽出に最も一般的に使用される溶媒は水性アルコールである。一部(プロラミン)は可溶性だが、他の部分(グルテリン)は不溶性残留物に残る。グルテリンまたは総グルテンタンパク質は、ジスルフィド結合の還元後にアルコール水溶液で抽出できる。尿素やドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの分解剤と温度の上昇により、溶解プロセスが加速する。抽出後の分析方法は、1ステップ手順(アルコール水溶液による直接抽出)、2ステップ手順(アルブミンと塩溶液によるグロブリンの事前抽出)、または3ステップ手順(アルブミン/グロブリンの後の抽出、プロラミン、およびグルテリン)を決めた後に必要である。タンパク質抽出の1ステップ手順は、単純さと再現性のために非常に望ましい。たとえば、発酵食品に含まれるグルテンペプチドは、通常、水/塩溶液とアルコール水溶液の両方に溶解する。
以前のドラフト改訂コーデックス規格(文書ALINORM 97/26)は抽出手順の詳細な説明を示したが、最近のコーデックススタン118-1979(文書08/31/26)はELISA R5メンデス法のみに言及している(以下の説明を参照)。文書ALINORM97
/ 26によると、食品または成分中のグルテンの測定は、40〜70%エタノールで抽出できるグルテンからの画分として定義されるプロラミンの測定に基づく必要がある。 60%の濃度が推奨されている-以前の研究では、小麦粉からのグリアジンの最適な抽出がこの濃度で達成されることが示されていた[97]。グルテリンは不溶性残留物に残り、分析には含まれない。脂肪含有量が10%を超える製品は、n-ヘキサンで脱脂する必要がある。次に、生成物を60℃で乾燥し、粉砕し、その重量の10倍の体積の60%水性エタノールで抽出する。遠心分離後、上清を取り除き、測定前に4℃で保存する。沈殿物が形成されると、それはスピンダウンされて廃棄される。液体製品の場合、アリコートを一定量の純粋なエタノールで希釈すると、得られる混合物に60%エタノールの濃度が得られる。カゼインまたは尿素を添加すると、プロラミンがマトリックスに結合するのを防ぐ。たとえば、お茶、ホップ、カカオ製品などのポリフェノールに結合する。
焼き菓子などの加熱サンプルからのプロラミンの不完全な抽出は、水性アルコールを使用する場合のグルテン分析の主要な問題である。グリアジン標準を添加した小麦パンの抽出研究では、システインを含むα-およびγ-グリアジンの抽出性は、対応する小麦粉と比較して大幅に低下したが、システインを含まないω-グリアジンの抽出性はほとんど影響を受けなかった[98]。α-およびγ-グリアジンは、熱ストレス下でのジスルフィド/スルフヒドリル鎖間反応により、アルコール不溶性グルテニンに結合することが示されている。 しかし、ジスルフィド結合の還元後、全グリアジン(およびグルテニンサブユニット)はパンからのアルコール抽出物に完全に回収される。
ω-グリアジンの熱安定性は、ω-グリアジンに対するモノクローナル抗体(mAbs)を用いたイムノアッセイの開発を開始した[99]。 40%エタノールは、すべての種類の食品(生、調理済み、焼き菓子)からω-グリアジンを定量的に抽出するのに最も適した抽出剤であることが示された。 加熱食品からのグルテンタンパク質の抽出を改善するための別の提案は、ペプシンによる限定的な加水分解であり、約90%の収率をもたらした[100]。 2段階の抽出プロトコル(段階1:50%2-プロパノール、)"室温;ステップ2:グルテンタンパク質を完全に抽出するには、Tris / HClバッファー(pH 7.5、60°C)中の50%2-プロパノール+ 1%ジチオスレイトールが推奨された[101]。
還元剤(2-メルカプトエタノール)と分解剤(グアニジン)の組み合わせであるいわゆるカクテルは、1つのステップで非加熱食品と加熱処理食品の両方からプロラミン(グルテリンと一緒に)を完全に抽出することを可能にした[102]。図4.6は、小麦粉と、22°Cから230°Cに加熱され、60%エタノール(A)またはカクテル(B)で抽出された対応する生地からのグリアジンの回収率を比較している。 60%エタノールで抽出されたグリアジンの回収率は、温度の上昇とともに大幅に低下しましたが、カクテルを使用した場合の回収率は常に高かった。未加熱製品と熱処理製品の両方の抽出に関しては、カクテルと50°Cで40分間インキュベートすることを勧める。カクテル溶液による抽出は、Codex Stan 118-1979およびCodex
Stan 234-1999(2011年に最終改訂された推奨分析およびサンプリング方法)で推奨されているR5 ELISA法の一部である(セクション3を参照)。
2-メルカプトエタノールは還元力が弱く、毒性があり、不快な悪臭があるため、タンパク質化学者は通常、高分子タンパク質を還元するための効果的で非毒性の薬剤としてジチオエリスリトールまたはジチオスレイトールを使用する(例:[98,101])。ただし、これらの薬剤は、ELISAキットには適さない温度である-18°C前後で保存する必要がある。 2-メルカプトエタノールに代わる有望な代替品は、トリス-2-カルボキシエチル-ホスフィン(TCEP)である[103]。グアニジン(修飾カクテル)との組み合わせにより、元のカクテルと比較して、グリアジンの抽出収率が類似していることが明らかになった。 TCEPは、競合ELISAと互換性のある抽出溶媒にも使用された[104]。 TCEP(5 mmol / L)をリン酸緩衝液(pH 7)中の界面活性剤N-ラウロイルサルコシン(2%)と組み合わせ、UPEX(ユニバーサルプロラミンおよびグルテリン抽出剤溶液)と呼ばれるこの抽出システムが、熱処理および/または加水分解されたものを含む、あらゆる種類の食品サンプルからグルテンタンパク質およびペプチドを抽出するため有用なツールであることが示された。
4.2 参照(レファレンス)タンパク質
測定されたシグナルをグルテン濃度に変換するための検量線を確立するためのすべてのグルテン定量法には、適切な参照タンパク質またはペプチドが不可欠である。さらに、曲線は濃度の範囲を反映しており、このメソッドでは正確な定量が可能である。このリファレンスをさらに使用して、アッセイ間のばらつきを最小限に抑え、さまざまなラボからさまざまな手法で得られた結果を比較できるようにすることができる。グルテン測定の場合、参照物質の重要な基準は、高タンパク質/ペプチド含有量、抽出溶媒への溶解性、均一性、安定性、CD毒性化合物との同等性、および測定技術への良好な応答である[95]。多くのプロラミン、主にグリアジン、およびグルテンのリファレンスは、独自のテストシステムで使用するためにさまざまな研究所や企業によって作成された。参照は、さまざまな手順によってさまざまなソースから分離され、タンパク質の含有量と組成はほとんど比較できなかった。その結果、同じ分析メソッドを使用した場合、ほとんどのリファレンスで検量線が発散した。例として、図4.7は、同じ抗原抗体反応における5つの市販のグリアジンリファレンスの異なる検量線を示している[105]。 Schwalbとその同僚による別の研究[106]では、4つの市販レファレンスである2つのグリアジンと2つの小麦グルテン製剤を、粗タンパク質の含有量(N×5.7)とオズボーン画分の比率について比較した。粗タンパク質の含有量は、グリアジンレファレンスで78.4%と91.9%、グルテンレファレンスでそれぞれ71.0%と77.0%であった。アルブミン/グロブリンの比率はかなり類似していたが(2.8-8.8%)、グリアジンの比率は30.7%から71.6%と非常に異なっていた(図4.8)。驚いたことに、両方のグリアジン製剤は、アルコール不溶性グルテニンを高い割合で含んでいた(25.4%と63.8%)。グルテンレファレンスは完全に異なる組成を示した。最初のものは35.9%のグリアジンと61.3%のグルテニンを含んでいたが、2番目のものは56.5%のグリアジンと34.7%のグルテニンで構成されていた。グルテン含有量(=グリアジン+グルテニン)に関しては、サンプルは同等で、91.2%と97.2%であった。したがって、市場で入手可能なタンパク質リファレンスは、粗タンパク質含有量とオズボーン画分の比率に大きな違いがあることを示している。したがって、キャリブレーションに使用されるリファレンスは、後続の分析手順で決定されるターゲットタンパク質について分析する必要がある。
ドラフト改訂コーデックス標準文書ALINORM97 / 26(1997)は、厳密に標準化された条件下で1つの研究所がゴールドスタンダードを作成することを推奨している。 このアドバイスを考慮して、プロラミン分析および毒性に関する作業部会(PWG)は、集合的に使用するためのグリアジンレファレンス(PWG-グリアジン)の準備を組織することを決定した[107]。 ヨーロッパの28品種の小麦の穀物を組み合わせて製粉し、得られた小麦粉を脱脂し、0.4 mol / LのNaClと60%エタノールで段階的に抽出した。 グリアジン抽出物を脱塩し、凍結乾燥し、均質化した。 得られたレファレンスは均質であり、60%エタノールに完全に溶解した。 粗タンパク質含有量(N×5.7)は89.4%で、グリアジン以外に3%のアルブミンとグロブリンしか存在しなかった。部分的に加水分解されたグルテン(サワードウ、スターチシロップ、麦芽抽出物、ビールなど)の定量に適したリファレンスを作成するために、小麦、ライ麦、大麦のプロラミン画分をペプシンとトリプシン、またはペプシンとキモトリプシンで消化した[108]。6つの異なる消化物を逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)とSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で比較したところ、無傷のタンパク質が消化物に存在しなくなったことがわかった。キャリブレーションの基本パラメータとして重要な粗ペプチド含有量(N×5.7)は、穀物の種類に応じて65.7%から96.0%の間で変動した。発酵飲料の分析は、酵素消化物と競合ELISAの組み合わせが、発酵製品中のグルテンペプチドの定量に適切なシステムであることを示した。
結論として、リファレンスの構造と組成は、ターゲット分析物のものと可能な限り類似している必要がある。プロラミン含有量は、プロラミンキャリブレータを使用して決定する必要がある; グルテン含有量とはプロラミンとグルテリンの適切な混合物を使用する。 場合によっては、特別なレファレンスを使用することを薦める(たとえば、大麦汚染のためのホルデイン調製物または発酵製品のための部分的に加水分解されたレファランス)。 検量線は、物質の量ではなく、常にタンパク質/ペプチドの含有量に基づいている必要がある。 全体として、プロラミンだけでなく、グルテリンやグルテンペプチドについても一般的に受け入れられている標準物質の開発は、さまざまなグルテン定量技術の結果を評価、検証、比較するための共通のプラットフォームを提供するため、不可欠である。
4.3 免疫化学的方法
これまで、免疫化学的アッセイはグルテン分析に最適な方法であり[95]、Codex Stan 118-1979およびCodex
Stan 234-1999で推奨されている。イムノアッセイは、抗体(免疫グロブリン)と、測定される物質である抗原との特異的反応に基づいている。抗体含有抗血清は、対応する抗原の注射による動物(例えば、ウサギまたはマウス)の免疫化によって産生される。次に、得られた抗血清の特異性をテストし、精製して望ましくない特異性を除去する。得られたポリクローナル抗体(pAbs)は、抗原のさまざまな結合部位(エピトープ)と反応する。グルテン定量の場合、pAbで分析した後に得られた結果は、穀物の種や品種の違いによる影響が少ない。ただし、この方法の欠点は、無毒の穀物のタンパク質と交差反応するリスクが高いことである。さらに、pAbは再現性のある組成と特異性で生成することはできない。より特異的なmAbは、免疫化後、単離された脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞を産生することによって産生される。次に、抗原に対する抗体が陽性であるこれらのハイブリドーマをクローン化し、細胞培養培地で増殖させる。結果として得られたmAb調製物は、沈殿および/またはアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。 mAbの利点には、特異性の絶対的な再現性とほぼ無制限の量を生成する能力が含まれる。イムノアッセイの中心的なポイントは、抗体/抗原複合体の定量である。以前は、沈殿物の形成またはマーカー(例えば、発光または蛍光色素、安定ラジカル、放射性同位元素)による標識が測定に使用されていた。今日、ELISAは最も頻繁に使用される技術であり、通常、グルテンの免疫化学的定量に適用される。最近では、免疫センサーが開発された。
4.3.1 ELISA
ELISAは比較的簡単に実行でき、他の手法よりも安価であることが多く、迅速な結果が得られる。使用される最も一般的なインジケーター酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(基質2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸))、アルカリホスファターゼ(基質4-ニトロフェニルホスフェート)、およびβ-D-ガラクトシダーゼ(基質4-ニトロフェニル- β-ガラクトシド)である。これらの酵素は、共有結合によって(例えば、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドとの反応によって)抗原に結合する。グルテン分析には、サンドイッチELISAと競合ELISAの2つのELISAシステムが最も頻繁に適用されている[95]。サンドイッチELISAの原理を図4.9(A)に示した。サンドイッチELISAでは、mAbまたはpAbをマイクロタイタープレートのウェルに固定化する。測定する抗原を含む抽出物のアリコートを加え、マイクロタイタープレートでインキュベートすると、抗体/抗原複合体が形成される(ステップ1)。洗浄後、インジケーター酵素で標識されたmAbまたはpAbが添加され、後続のインキュベーションステップ(ステップ2)中に抗原の2番目の結合部位に結合される。したがって、抗原は、支持体に結合した非標識抗体と酵素標識抗体の間に「挟まれ」る。結合していない酵素標識抗体を洗い流した後、酵素の基質を加え、着色された最終産物に変換し、分光光度法で測定する(ステップ3)。測定された吸光度は、抽出物中の抗原濃度に正比例します。これは、参照タンパク質と検量線を使用して計算できる。「サンドイッチELISAは、大きな抗原(タンパク質)にのみ適している。これは、抗原が、支持体結合抗体と酵素標識抗体の両方に結合するために空間的に分離された少なくとも2つの結合エピトープを持っている必要があるためである。グルテン分析の場合、サワードウ製品、麦芽抽出物、ビールなどの部分的に加水分解された(発酵)製品を分析する必要がある場合、グルテンペプチドには結合部位が1つしか残っていない可能性があるため、サンドイッチELISAは不適切である。 図4.9さまざまなELISAフォーマット:(A)サンドイッチELISA;
(B)競合ELISA。参考文献から引用[95]。 競合ELISAは、インタクトなタンパク質だけでなく、抗原性エピトープが1つしかない小さなサイズの抗原(ペプチド)にも適している。このアッセイは3つの要素で構成されている(図4.9(B))[95]: 1.マイクロタイタープレートに固定化された抗原。 2.限られた一定量の酵素標識抗体。 3.抽出物からの抗原。標識された抗体とサンプル抗原がマイクロタイタープレートに追加され、遊離抗原と固定化抗原が抗体結合部位をめぐって競合する。添加するサンプル抗原の量が多いほど、固定化された抗原に結合する標識抗体の量は少なくなる(ステップ1)。結合していない標識抗体は洗い流され、酵素基質が添加されて着色された最終生成物に変換され、分光光度法で測定される(ステップ2)。抽出抗原の量が多いほど、酵素標識抗体によって生成される色は薄くなる。レファレンスタンパク質またはペプチドを使用して作成された検量線により、サンプル抗原の定量が可能になる。 グルテンを定量するための多数のELISAシステムが、さまざまな研究グループや企業によって開発されている。段階的な進歩は、Denery-Papini
et al., [94]とヴィーザー[95] によって要約されている。ELISA検出法の精度の評価は、Diaz-AmigoとPoeppingによって提示されている[109]。適切なイムノアッセイを作成するための試行回数が多いため、現在市販されているELISAキットの原理のみをここで説明する(表4.2)。市場で最も古いイムノアッセイは、1990年にSkerritt and Hillによって開発された[99]。このサンドイッチELISAは、熱安定性ω-グリアジンに対してmAb(401.21)を使用する。この試験は、あらゆる種類の未調理および熱処理食品中のグルテンの定量に適していることが示唆されている。オーストラリアの小麦栽培品種Timgalenから40%エタノールで抽出されたグリアジン調製物がレファレンスタンパク質として提供されている。このアッセイは、共同研究での評価に成功し、公式分析化学者協会(AOAC
International)によって検証され、いくつかの企業によって特許が取得され、販売されている。さまざまなテストキットのメーカーが示す感度は、20mgから160mgのグルテン/ kgの範囲である。このアッセイの主な欠点は、オオムギとオーツ麦のプロラミンの認識が非常に悪いことと、総グリアジンの約7%から20%の範囲のω-グリアジンの比率が異なるため、結果が品種に強く依存することである[97]。家庭での使用またはプロセスの品質管理に適した2番目の迅速検査キットは、迅速な定性的または半定量的結果を提供し、CD患者のGFDへの準拠を改善するために開発された[110]。マドリッドのメンデスグループは、ω-セカリンに対して生成され、プロラミンのCD毒性配列で発生するQQPFP、QQQFP、LQPFP、QLPFPなどのエピトープに対して向けられたmAb(R5)に基づくサンドイッチELISAを開発した[111]。 R5抗体は、グルテリンとの反応が非常に限られており、オーツ麦タンパク質との反応はない。最初のデータは、R5 ELISAが小麦、ライ麦、大麦のプロラミンを同程度に認識することを示した[111]。最近のデータは、R5 mAbがグリアジンと比較してセカリンおよびホルデインに対してより高い反応性を有することを示唆しており、したがって、グリアジン参照をキャリブレーションに使用すると、それらの含有量が過大評価される [108,112]。ホルデイン内では、2つのサンドイッチELISAキットの応答は、B-、γ-、D-、またはC-ホルデインのいずれかが濃縮されたホルデイン画分に応じて大幅に異なった[113]。 R5 mAbを使用するいくつかの異なるテストキットが現在市場に出ており、ほとんどのシステムは、van Eckert et alによって記述されたレファレンスグリアジン(PWG-グリアジン)に適合している。 [107]。 60%エタノールまたはカクテルの2つの抽出方法が提案されている(セクション4.1を参照)。サンドイッチR5ELISAは、共同研究 [114,115]、2005年にコーデックス分析およびサンプリング方法委員会(CCMAS)によってタイプIの方法として承認され、コーデックススタン118-1979およびコーデックススタン234-1999によって推奨され、AACCI承認メソッド38-50.01として承認された。このアッセイでは、1.5mgグリアジン/ kgの検出限界(LOD)と2.5mgグリアジン/ kgの定量限界(LOQ)が保証されてる。テストを簡素化および高速化するために、R5mAbが固定化されたスティックを含むキットが開発された[116]。サンプルに対応するプロラミンが含まれている場合、スティックは希釈されたサンプル抽出物に浸され、赤い線が表示される。このアッセイの感度は、約10mgグルテン/ kg製品である。テーブルや機械などの環境でグルテン汚染をチェックするための綿棒として特に適している。2012年に、R5mAbを使用した競合ELISAが開発された[117]。このテストでは、結合に1つのエピトープのみが必要であり、部分的に加水分解されたプロラミンに由来する小さなペプチド、たとえばサワードウ製品、麦芽抽出物、ビールなどの発酵穀物食品に存在するペプチドも検出できる。さらに、競合システムは、抗体が1つだけ使用され、サンプルとコンジュゲート抗体のインキュベーションがアッセイ内の1つのステップで実行されるため、サンドイッチシステムよりも安価で高速である。第1世代ELISAのキャリブレーターは、シーケンスQQPFPの合成ペプチドであり、第2世代ELISAのキャリブレーターは、小麦、ライ麦、および大麦のプロラミンからの消化性トリプシン加水分解物の混合物だった。 LODは1.4mgプロラミン/ kgである。競合R5ELISAと参照としてのプロラミン加水分解物の組み合わせは、発酵製品中の少量のプロラミンペプチドの定量に適していることが示された[108]。共同研究が成功したことにより、このメソッドはAACCI承認メソッド38-55.01として承認された
[118]。競合するR5ELISAの欠点は、エタノールとのみ互換性があり、カクテルとは互換性がないことである。ただし、Mena et al.,は競合ELISAは、あらゆる種類の食品サンプルの分析に抽出溶媒UPEXと組み合わせて使用できることを実証した[104]。
G12およびA1という名前の2つのmAbは、α2-グリアジンの33 merペプチドに対して生成され、サンドイッチおよび競合ELISAの開発に使用された[119,120]。 33-merペプチドに対するG12の親和性は、A1よりも優れていることが示されたが、グルテン検出の感度はA1の方が高かった。サンドイッチELISAには、酵素標識抗体としてG12が含まれ、支持体結合抗体としてA1が含まれている。競合ELISAにはG12のみが含まれている。アッセイは、還元剤を含む抽出溶媒を提供するため、非加熱製品と熱処理製品の両方の分析が可能である。グルテンとPWG-グリアジンは、キャリブレーションのレファレンスタンパク質として機能する。サンドイッチELISAと競合ELISAはどちらも、小麦、ライ麦、大麦のプロラミンのLOD(limit of detection)が2mgグルテン/ kgおよび4mgグルテン/ kgのLOQ(limit of quantitation)を示す。オーツ麦プロラミンの検出限界ははるかに高い。無毒な穀物のタンパク質に対する交差反応性は観察されていない。 G12 / A1サンドイッチELISAの共同研究が最近行われ、この方法は2014年に承認された方法38-52.01としてAACCIによって承認される予定である。 EuroProxima(Arnheim、The Netherlands)と協力して、ライデン大学医療センター(Leiden、The Netherlands)は、RPQQPY [121]の配列を含むα20-グリアジンのエピトープを検出するモノクローナル抗体に基づいて、Gluten-Tec®という名前の競合ELISAを開発した。このアッセイでは、還元剤として60%エタノールとジチオスレイトールを含む抽出溶媒を使用するため、未加熱および加熱処理された食品の抽出が可能である。 α20抗体は、小麦およびライ麦のプロラミンに対して同等の反応性を示すが、大麦のプロラミンに対してはわずかに低下した反応性を示す。この抗体は、オーツ麦に対する感受性がはるかに低く、米、トウモロコシ、その他の無毒な穀物のタンパク質と交差反応しない。 Gluten-Tec®ELISAは、合成ペプチドGPFRPQQPYPBで校正する。 ngペプチド/ kg食品で得られた結果は、それぞれmgプロラミンとmgグルテン/ kg食品に変換する必要がある。共同研究により、サンドイッチR5ELISAで得られたものと同様の再現性が明らかになった[122]。 ngペプチド/ gからngグリアジン/ gへの100の変換係数は、小麦粉をスパイク(
加えた )したコーンブレッドサンプルの分析によって実験的に決定された。平均LODは、それぞれ0.41ngペプチド/ ml(エタノール抽出)および0.46ngペプチド/ ml(ジチオスレイトール抽出)だった。ペプチド濃度(ng / ml)は、100の係数を掛けることにより、サンプル中のペプチド濃度(ng / g)に変換される。ペプチドの量とグリアジン含有量の相関に基づいて、ngペプチド/ gからの変換係数〜ngグリアジン/ gは100である。結果のLODは2.5mgグリアジン/ kgである。将来の実験では、ペプチドとグルテンの間の変換係数を異なるマトリックスのサンプルに転送できることを実証する必要がある。
4.3.2
免疫センサー
Nassefらによって開発された免疫センサー[123]は、免疫優勢CDエピトープα56-75に対して産生された抗体と、捕捉抗体を固定するためにジチオール化合物を使用する化学的表面に基づいている。この免疫センサーに基づく方法は、高感度で再現性があることが示された。市販のグルテンフリーおよびグルテン含有の生および加工食品の分析に適用すると、抗グリアジンpAbに基づく以前に開発されたELISAと比較した場合、優れた相関関係が達成された。天然および前処理された食品サンプル中のグリアジンまたは小さなグリアジンフラグメントを定量するための電気化学的磁気免疫センサーは、Laube et al.,によって説明されている[124]。免疫学的反応は、トシル活性化ビーズ上へのグリアジン抗原の配向共有結合固定化による固体支持体としての磁性ビーズ上で実施された。グルテンフリー製品の法律に従って優れた検出限界が達成され、スパイクされたグルテンフリー食品を使用してアッセイが正常に評価された。
4.4 非免疫化学的方法
4.4.1 ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特定のデオキシリボ核酸(DNA)フラグメントの測定に基づいている。 DNA分析は、タンパク質分析よりも数桁感度が高くなっている。任意のDNA配列のいくつかの分子は、非常に短時間で106〜108倍に増幅できる。 DNAはタンパク質よりもかなり熱安定性が高いため、PCRは非加熱製品と熱処理製品の両方に適用できる。 PCRは、DNAポリメラーゼによって触媒される増幅反応でプライマーとして機能する2つのオリゴヌクレオチドに隣接する特定のDNAフラグメントの増幅を可能にする。増幅産物は、ゲル電気泳動後、蛍光色素、キャピラリー電気泳動、またはサザンブロッティング(定性的PCR)によって視覚化される。定量的PCRには、蛍光マーカーまたは酵素マーカーで標識されたオリゴデオキシヌクレオチドが使用され、蛍光または色の強度を測定することによって定量が実行できる(「リアルタイム」PCR)。 BerneのAllmannのグループは、グルテン分析にPCRを適用した最初のグループだった。非常に反復的で特異的なゲノムコムギDNAセグメントが、コムギの検出に適用された[125]。この定性分析は、ベーカリー添加物から加熱および加工製品に至るまで、35の異なる食品サンプルでテストされた。グリアジン含有量が少なくても小麦澱粉は強く反応したが、添加剤として使用した小麦グルテンは検出できなかった。 PCRとサンドイッチELISAは、小麦をスパイクしたオーツ麦サンプルの分析によって比較された[126]。結果は、PCRがELISAシステムよりも約10倍感度が高いことを示した。 特定のプライマーペア(WBR11
/ WBR13)を使用して小麦、ライ麦、大麦の汚染を検出するために、定量的で競合的なPCRシステムが開発された[127]。内部DNA標準は、元のPCR産物に20塩基対を追加することによって構築された。 PCRシステムは、グルテンフリーとラベル付けされた15の市販製品に適用され、サンドイッチELISAと比較された。どちらの方法でも、ほとんどのサンプルで同じ結果が得られ、グルテンフリー製品のテストで相互にサポートすることが提案された。プライマーペアは、定量PCRシステムでも使用され、グルテンフリーと指定された粉の4つのサンプルとビスケットの13のサンプルで微量のグルテンを検出した[128]。融解曲線分析を使用したリアルタイムPCRは、食品サンプル中の小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦の汚染を識別するために特別に確立された[129]。PCRとサンドイッチELISAの同時分析は良好な相関関係を示した。ゲル電気泳動よりも融解曲線分析を使用する利点は、増幅に使用したのと同じクローズドキャピラリーで分析を実行できることである。したがって、サンプルの相互汚染のリスクを排除することができる。
Henterich et al., によって、グリアジン検出のためにワンステップのリアルタイム免疫PCRが導入された[130]。この手法では、R5モノクローナル抗体をオリゴヌクレオチドと結合させた。グリアジン分析の感度は、ELISAで到達したレベルよりも30倍以上増加した。小麦、ライ麦、大麦のDNAを測定するための3つの異なるリアルタイムPCRシステムが、Mujicoのグループによって開発された[131,132]。これらのシステムの組み合わせにより、穀物の種類の識別と、汚染されたオーツ麦サンプル中の小麦、ライ麦、大麦の割合の決定の両方が可能になった。コーンスターチと非加熱食品サンプルの分析に使用されたPCRとR5ELISAの比較により、良好な線形相関が明らかになった [133]。リアルタイムPCR法の実用性は、49の食品サンプルの分析によってテストされた。 49サンプルのうち3サンプルはPCRとELISAの両方でグルテン陽性であり、1サンプルはPCRでのみ陽性であることがわかった[134]。 HMW-GSをコードする相同標的配列を含むリアルタイムPCRアッセイを使用して、さまざまな小麦種(一般的な小麦、スペルト小麦、カムット)、大麦、およびライ麦を検出した[135]。システムの感度はマトリックス(共雑分)に依存し、2.5mg小麦/ kg(野菜マトリックス)から5.0 mg / kg(肉マトリックス)の範囲であった。オーツ麦と大麦に固有のシステムでは、10
mg / kgの感度が得られた。グルテンフリー食品中の小麦汚染を定量化するための高感度リアルタイムPCRシステムは、Mujicoとその同僚によって開発および最適化された[136]。さまざまな製品の分析により、R5ELISAと比較してPCR技術の感度が高いことが示された。 要約すると、開発された定量PCRシステムは、小麦、ライ麦、大麦の存在に対する高感度のスクリーニングツールとして推奨できる。それは免疫学的方法を補完するものと見なすことができる。ただし、PCRはタンパク質ではなくDNAを検出することを覚えておく必要がある。小麦、ライ麦、大麦のPCRスクリーニング実験で陽性のサンプルは、グルテンタンパク質を対象とした分析方法で再分析する必要がある。 PCRは、ビール、シロップ、麦芽抽出物などの部分的に加水分解された製品中のグルテンや、添加剤として使用される重要な小麦グルテンの検出と定量にも適していない。
4.4.2
電気泳動
電気泳動によるタンパク質の分離は、荷電アミノ酸残基の数の違いによって引き起こされる電場の異なる移動度に基づいている。穀物の分野での電気泳動の応用は、タンパク質(ペプチドではない)と定性的特性評価(定量ではない)に焦点を合わせてきた。穀物タンパク質の電気泳動は、主にデンプンゲルでの移動境界電気泳動の使用から始まった。その後、これはPAGEに置き換えられ、はるかに優れた分離が提供された。分離後のさまざまな検出方法が開発されており、クマシーブルーとシルバーが最も一般的に適用される染色剤である。重要な電気泳動原理は酸(A-)PAGEである。これは、低pHでのタンパク質の電荷密度の違いに基づいており、主にフィンガープリント、特に栽培品種の分化と同定に関する研究でのプロラミンのフィンガープリントに使用される。ゲル上での移動度の増加に応じて、グリアジンはω-、γ-、β-、およびα-グリアジンに分類され、セカリンはω-およびγ-セカリンに分類された。しかしながら、アミノ酸配列に関するその後の研究は、電気泳動移動度に基づく分類が、アミノ酸配列に基づく「真の」分類と常に一致するとは限らないことを示した。たとえば、配列分析に基づいて、α-およびβ-グリアジンは1つのグループに分類される。 従来のキャピラリー電気泳動は、電荷とサイズの違いに応じてタンパク質を分離する。分析物は、電界により導電性媒体で満たされた小さなキャピラリーの内部を移動し、溶出後のUV吸光度またはレーザー誘起蛍光によって検出できる。 SDS-PAGEの原理は、分子サイズ(質量)のみに依存して、タンパク質が電場で分離されるように、過剰な負に帯電したドデシル硫酸アニオンでタンパク質を覆うことに基づいている。 D-、C-、B-、A-ホルデイン、HMW-GS、LMW-GS、単一のHMW-GSなど、SDS-PAGEの移動度に応じて名前が付けられている穀物タンパク質もある(例:1〜12番)。ここで、SDS-PAGEでの見かけの分子量は、アミノ酸配列に由来する真の質量よりもはるかに高い(+ 10%以上)と推定されていることに注意すること。 A-PAGEまたはSDS-PAGEで分離されたタンパク質は、抗体との反応により特異的に検出できる。タンパク質は、電流を使用して、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデンで作られたメンブレンに転写されます(いわゆるウエスタンブロッティング)。その後、検出可能な標識を含むタンパク質特異的抗体(例えば、ELISA技術と同様のレポーター酵素)が追加される。ラベルと適切な基板の間の反応により、目に見える生成物が生成される。 等電点電気泳動(IEF)の手法は、タンパク質のさまざまな等電点に基づいているため、固定化pH勾配ゲルで分離できる。 IEF(一次元)は、二次元(2D-)ゲル電気泳動のためにSDS-PAGE(二次元)と組み合わせて頻繁に使用される。 2D電気泳動は、タンパク質の最も効果的な分離方法の1つである。たとえば、小麦粉タンパク質は数百のスポットに分離できる(図2.3)。プロテオミクスの分野では、2Dゲル電気泳動によって分離されたタンパク質は、質量分析(MS)ペプチドマッピングおよびデータベース検索アルゴリズム(手順)によるトリプシン消化後に同定できる。 プロテオミクスは、CD研究で頻繁に使用される。たとえば、腸組織に固有のタンパク質発現を特定したり、体液中の診断バイオマーカーを決定したり、細胞プロセスの最終産物のフィンガープリントを作成したりする[137,138]。
4.4.3
カラムクロマトグラフィー
カラムクロマトグラフィーは、穀物タンパク質の特性評価、分離、および定量に広く使用されている。 特に、ゲル浸透(GP-)液体クロマトグラフィー(分子量に基づいて分離)「およびサイズ」および逆相(RP-)液体クロマトグラフィー(疎水性に基づいて分離)は1980年代から適用されてきたが、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーは過去数十年の間に重要性を失っている。特別な場合には、アフィニティークロマトグラフィーが適用されている。これは、非常に特異的な相互作用(たとえば、抗原と抗体、酵素と基質、または受容体とリガンドの間)に基づく方法である。カラム材料の改良により、HPLCの適用が可能になり、分離効率が向上し、溶出時間が大幅に短縮された[139]。溶出したタンパク質の検出と定量は、200〜220nmの範囲のUV吸光度を測定することによって実行される。これらの波長では、吸光度の単位はタンパク質の種類に関係なくタンパク質の量と高い相関があり、検出限界は約1〜2μgのタンパク質である[140]。 GP-およびRP-HPLCは、適切なカラム材料が使用されている場合、ペプチド混合物の分離および定量にも使用できる。重要な欠点は、検出技術がグルテンタンパク質と非グルテンタンパク質を区別できないため、非特異的であり、複雑な食品の分析には適用できないことである。ただし、特別な場合には、カラムクロマトグラフィーをグルテン測定に適用できる。 この制限にもかかわらず、カラムクロマトグラフィー、特にRP-HPLCは、CD研究において非常に価値のある支援である。たとえば、グルテン分析に必要な標準物質の特性評価、CDの病態メカニズムに関与するタンパク質とペプチドの分離と同定、およびタンパク質とペプチドの代謝のフォローアップに頻繁に使用されている。また、植物育種や遺伝子工学の追跡にも適用できる。さらに、液体クロマトグラフィーと質量分析(LC-MS)の組み合わせは、今日、高い特異性と感度でタンパク質とペプチドを同定および定量するために不可欠な機器である。 GP-HPLCは、グルテンフリーのパン製造のベース材料として広く使用されている小麦デンプンのグリアジンとグルテンの両方の測定に適用できる[22]。さまざまな会社から提供された23のデンプンサンプルを、60%エタノール(グリアジン)または50%2-プロパノールと還元剤(グルテン)のいずれかで抽出した。抽出物を真空遠心分離機で濃縮し、GP-HPLCで分析した。結果は、15〜574 mg / kgデンプンの広範囲のグリアジン濃度を示した。 2回の測定から得られた平均変動係数は±2.6%であった。グリアジンの含有量と粗タンパク質の相関係数(N×5.7)はr =
0.232であった(図4.2)。これは、粗タンパク質の含有量がコーデックス委員会の最初のドラフトで想定されているグリアジンの含有量を反映していないことを示している(セクション3.1を参照)。グリアジンとグルテニンの比率(後者はグルテンからグリアジンを差し引いて計算)を考慮すると、大きな違いが見られ(0.2-4.9)(図4.10)、グルテンのプロラミン含有量が50%であるという一般的な仮定を示している点(Codex Stan 118 -1979)は正当化されない。この発見は、さまざまな小麦種、ライ麦、大麦、およびオート麦の栽培品種からのプロラミンおよびグルテリンのRP-HPLC分析によって確認された[141]。比率は1.4から13.9の範囲であった(図4.10)。したがって、プロラミン含有量に2の係数を掛けることによって計算されたグルテン含有量は、部分的にかなり過大評価されている。グルテンフリー製品の製造に使用される他のいくつかの原材料は、GP-HPLC法によってテストされた。プロラミンとグルテンの測定は、原則として、リンゴ繊維、そば粉、スパイス混合物、栗粉、キビ粉、米粉では可能でしたが、脱脂乳粉とコーンフラワーでは不可能であった[22]。
4.4.4 質量分析
マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF
MS)は、タンパク質およびペプチドの分子量を決定するための重要な方法になっている。この手法の原理は、短いレーザーパルスによって高真空中で分析物マトリックス共結晶化物からイオンが生成されることである。レーザーによって放出されたイオンは、短い高電圧インパルスによってTOFMS機器に加速される。重いイオンは軽いイオンよりも遅いため、飛行時間は分析対象物の質量電荷比(m /
z)に比例する。キャリブレーションは既知の質量の分析物を使用して実行され、電界を反射体として使用してイオンの飛行経路を2倍にすることで分解能が向上する。 MALDI-TOF MSを使用すると、数分以内に低ピコモル範囲のクロマトグラフィー精製を行わなくても、約1000〜100,000の質量を同時に測定できる。したがって、インタクトなタンパク質だけでなく、タンパク質加水分解物も分析することができる。 マドリッドのメンデスのグループは、さまざまな穀物からのプロラミンの同定にMALDI-TOFMSを最初に使用した[142]。サンプル前処理は非常に簡単であることが示され、タンパク質抽出に還元剤を使用しても分析が妨げられることはなかった。 30の食品サンプル(小麦パンとデンプン、グルテンフリー食品)は、MALDI-TOFMSと実験室で作られたサンドイッチELISAによって同時に分析された[143]。 MSの結果は、4〜100mgグリアジン/ kg製品の範囲で線形応答を示し、ELISAの応答との良好な相関関係を示した。グリアジン、セカリン、ホルデイン、およびアベニンは、複雑な食品マトリックス(共雑物質)に同時に存在する場合でも、MALDI-TOFMSで選択的に区別できる[144,145]。 Iamettiのグループは、MALDI-TOF MSを使用して、サンドイッチELISAでは検出できなかった多くのビール中のグルテン由来ペプチドの特性を明らかにした[146,147]。さまざまな国で生産されたビールは、ペプチドプロファイルが大きく異なり、最も関連性の高い違いは、低質量領域(<5000)で見つかった。液体クロマトグラフィー(LC)とQ-TOF MSを組み合わせた組み合わせ技術を適用して、トリプシンで消化した後のグルテン含有およびグルテンフリーの原材料から作られたビールを分析した[148]。 ELISAによる補足分析は、MSで検出可能なグルテンを含むいくつかのサンプルがELISAで低い応答しか示さなかったことを示した。グルテン源(小麦や大麦など)は特定できたが、適用されたMS技術ではグルテン含有量の定量データを提供できなかった。 2010年に、LC-MS / MSは、ネイティブおよび加工食品サンプル中の小麦グルテンペプチドの定量のために開発された[149]。サンプルをペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンで消化し、6つの免疫原性グルテンマーカーペプチドに基づくLC-MS / MSで分析した。このメソッドは、0.01〜100mgペプチド/ kg製品の範囲でこれらのマーカーペプチドを検出した。ただし、6つのマーカーペプチドの非常に異なる比率がさまざまな食品で見つかった。「グルテン含有量は不可能に見え、試みられなかった。 同様に、60種類のビールの平均ホルデイン含有量のパーセンテージとして表される相対値のみが、トリプシン消化の有無にかかわらずペプチドのLC-MS分析後に計算できた。 タンパク質ごとに少なくとも2つのペプチドがマーカーとして選択され、マルチプルリアクションモニタリング(MRM)モードで定量化され、ビール中のホルデインの検出が可能になった[150]。 全体として、質量分析はグルテンタンパク質およびペプチドの検出のための非常に価値のある非免疫学的アプローチである。 ただし、コーデックス委員会やその他の規制で要求されているように、取得したデータをmgグルテン/ kg製品に変換することはまだできてない。 さらに、それが必要とする高価な機器と専門知識は、この技術の使用を専門のサービス研究所と大手食品メーカーに制限している。