4. 　グルテン分析

分析手法は、世界中の食品品質の評価と維持に重要な役割を果たしている。特に、有毒化合物など、消費者の健康に影響を与える食品成分や添加物の正確な分析が不可欠である。ほとんどの有毒な食品成分は、アクリルアミドなどの単一の化合物またはマイコトキシンなどの化合物の小グループのいずれかである。それらの検出と定量化の方法は、それらの特別な構造に関連して決定することができる。ただし、CD(Celiac disease)の場合、沈殿要因であるグルテンは、異なる構造を持つタンパク質の複雑な混合物である。グルテンの組成は、その植物起源（例、穀物種、品種）、植物が生産された農業条件（例、気候、土壌、施肥）、および食品加工手順（例、加熱、酵素分解）によって異なる 。さらに、グルテン中のタンパク質内の毒性エピトープに関する知識は不完全である。多くの研究所は、過去数十年にわたって正確なグルテン測定のための解決策を探してきたが、最終的な広く受け入れられている解決策に到達することはなかった。

 

1950年代以来、GFD（Gluten-free diet）の厳格な遵守がCDの不可欠な治療法であることが知られている。グルテンの1日摂取量は20mg未満である必要がある。小麦、ライ麦、大麦、オート麦のグルテンを含む食品はすべて避け、グルテンを含まない代替食品に置き換える必要がある。コーデックス委員会およびその他の国際機関および国内機関は、CD患者の特別な食事使用のための食品中のグルテンの許容レベルを規制している。 Codex Alimentariusによると、グルテンを含まない食事は20mgグルテン/ kgを超えてはならない。グルテン含有量を減らすために特別に加工された食品の場合、国レベルで100 mg / kgのしきい値を許可できる。

 

食品中のグルテンの検出と正確な定量は、CD患者だけでなく、グルテンフリー食品を製造する業界や食品管理にとっても不可欠である。適切なメソッドの最小要件には、十分な感度、選択性、およびキャリブレーション用の認定された標準物質が含まれている必要がある。さらに、それらは生の材料だけでなく、加工された材料（熱処理、発酵、酸処理）にも適用可能でなければならない。大事なことを言い忘れたが、それらは共同研究で評価され、商業的アッセイとして利用可能でなければならない。分析手順には、基本的に3つのステップが含まれる。

 

1.マトリックスからのグルテンタンパク質/ペプチドの完全な抽出。 2.キャリブレーションのための代表的なタンパク質/ペプチドリファレンスの適用。

3.抽出されたグルテンタンパク質/ペプチドの正確な定量。

 

グルテンの定量に関する数多くの研究が過去数十年の間に発表されている。初期の結果はDenery-Papiniとその同僚[94]によって要約され、Wieser [95]とHarasziと同僚[96]によるより最近の結果で完成した。免疫学的手法、特にELISAは、原材料や食品中のグルテンタンパク質やペプチドの分析に焦点を当ててきた。非免疫学的方法は、独立した制御方法と同様に重要である。代替技術として、ポリメラーゼ連鎖反応、質量分析、およびカラムクロマトグラフィーが提案されている。さらに、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動、質量分析などのさまざまな分析手順が、CDの病態メカニズムの理解の進歩に決定的に貢献している。

 

 4.1 　タンパク質抽出

グルテン含有材料、原材料、食品は、多くの成分で構成されている。したがって、グルテン分析の最初のステップは、後続の定量方法とは関係なく、マトリックスからグルテンタンパク質を抽出することである。天然グルテンタンパク質は、水や塩溶液に溶けない。グルテンタンパク質の抽出に最も一般的に使用される溶媒は水性アルコールである。一部（プロラミン）は可溶性だが、他の部分（グルテリン）は不溶性残留物に残る。グルテリンまたは総グルテンタンパク質は、ジスルフィド結合の還元後にアルコール水溶液で抽出できる。尿素やドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの分解剤と温度の上昇により、溶解プロセスが加速する。抽出後の分析方法は、1ステップ手順（アルコール水溶液による直接抽出）、2ステップ手順（アルブミンと塩溶液によるグロブリンの事前抽出）、または3ステップ手順（アルブミン/グロブリンの後の抽出、プロラミン、およびグルテリン）を決めた後に必要である。タンパク質抽出の１ステップ手順は、単純さと再現性のために非常に望ましい。たとえば、発酵食品に含まれるグルテンペプチドは、通常、水/塩溶液とアルコール水溶液の両方に溶解する。

 

以前のドラフト改訂コーデックス規格（文書ALINORM 97/26）は抽出手順の詳細な説明を示したが、最近のコーデックススタン118-1979（文書08/31/26）はELISA R5メンデス法のみに言及している（以下の説明を参照）。文書ALINORM97 / 26によると、食品または成分中のグルテンの測定は、40〜70％エタノールで抽出できるグルテンからの画分として定義されるプロラミンの測定に基づく必要がある。 60％の濃度が推奨されている-以前の研究では、小麦粉からのグリアジンの最適な抽出がこの濃度で達成されることが示されていた[97]。グルテリンは不溶性残留物に残り、分析には含まれない。脂肪含有量が10％を超える製品は、n-ヘキサンで脱脂する必要がある。次に、生成物を60℃で乾燥し、粉砕し、その重量の10倍の体積の60％水性エタノールで抽出する。遠心分離後、上清を取り除き、測定前に4℃で保存する。沈殿物が形成されると、それはスピンダウンされて廃棄される。液体製品の場合、アリコートを一定量の純粋なエタノールで希釈すると、得られる混合物に60％エタノールの濃度が得られる。カゼインまたは尿素を添加すると、プロラミンがマトリックスに結合するのを防ぐ。たとえば、お茶、ホップ、カカオ製品などのポリフェノールに結合する。

 

焼き菓子などの加熱サンプルからのプロラミンの不完全な抽出は、水性アルコールを使用する場合のグルテン分析の主要な問題である。グリアジン標準を添加した小麦パンの抽出研究では、システインを含むα-およびγ-グリアジンの抽出性は、対応する小麦粉と比較して大幅に低下したが、システインを含まないω-グリアジンの抽出性はほとんど影響を受けなかった[98]。α-およびγ-グリアジンは、熱ストレス下でのジスルフィド/スルフヒドリル鎖間反応により、アルコール不溶性グルテニンに結合することが示されている。 しかし、ジスルフィド結合の還元後、全グリアジン（およびグルテニンサブユニット）はパンからのアルコール抽出物に完全に回収される。

 

 ω-グリアジンの熱安定性は、ω-グリアジンに対するモノクローナル抗体（mAbs）を用いたイムノアッセイの開発を開始した[99]。 40％エタノールは、すべての種類の食品（生、調理済み、焼き菓子）からω-グリアジンを定量的に抽出するのに最も適した抽出剤であることが示された。 加熱食品からのグルテンタンパク質の抽出を改善するための別の提案は、ペプシンによる限定的な加水分解であり、約90％の収率をもたらした[100]。 2段階の抽出プロトコル（段階1：50％2-プロパノール、）"室温;ステップ2：グルテンタンパク質を完全に抽出するには、Tris / HClバッファー（pH 7.5、60°C）中の50％2-プロパノール+ 1％ジチオスレイトールが推奨された[101]。

 

還元剤（2-メルカプトエタノール）と分解剤（グアニジン）の組み合わせであるいわゆるカクテルは、1つのステップで非加熱食品と加熱処理食品の両方からプロラミン（グルテリンと一緒に）を完全に抽出することを可能にした[102]。図4.6は、小麦粉と、22°Cから230°Cに加熱され、60％エタノール（A）またはカクテル（B）で抽出された対応する生地からのグリアジンの回収率を比較している。 60％エタノールで抽出されたグリアジンの回収率は、温度の上昇とともに大幅に低下しましたが、カクテルを使用した場合の回収率は常に高かった。未加熱製品と熱処理製品の両方の抽出に関しては、カクテルと50°Cで40分間インキュベートすることを勧める。カクテル溶液による抽出は、Codex Stan 118-1979およびCodex Stan 234-1999（2011年に最終改訂された推奨分析およびサンプリング方法）で推奨されているR5 ELISA法の一部である（セクション3を参照）。

2-メルカプトエタノールは還元力が弱く、毒性があり、不快な悪臭があるため、タンパク質化学者は通常、高分子タンパク質を還元するための効果的で非毒性の薬剤としてジチオエリスリトールまたはジチオスレイトールを使用する（例：[98,101]）。ただし、これらの薬剤は、ELISAキットには適さない温度である-18°C前後で保存する必要がある。 2-メルカプトエタノールに代わる有望な代替品は、トリス-2-カルボキシエチル-ホスフィン（TCEP）である[103]。グアニジン（修飾カクテル）との組み合わせにより、元のカクテルと比較して、グリアジンの抽出収率が類似していることが明らかになった。 TCEPは、競合ELISAと互換性のある抽出溶媒にも使用された[104]。 TCEP（5 mmol / L）をリン酸緩衝液（pH 7）中の界面活性剤N-ラウロイルサルコシン（2％）と組み合わせ、UPEX（ユニバーサルプロラミンおよびグルテリン抽出剤溶液）と呼ばれるこの抽出システムが、熱処理および/または加水分解されたものを含む、あらゆる種類の食品サンプルからグルテンタンパク質およびペプチドを抽出するため有用なツールであることが示された。

 

4.2  参照（レファレンス）タンパク質

 

測定されたシグナルをグルテン濃度に変換するための検量線を確立するためのすべてのグルテン定量法には、適切な参照タンパク質またはペプチドが不可欠である。さらに、曲線は濃度の範囲を反映しており、このメソッドでは正確な定量が可能である。このリファレンスをさらに使用して、アッセイ間のばらつきを最小限に抑え、さまざまなラボからさまざまな手法で得られた結果を比較できるようにすることができる。グルテン測定の場合、参照物質の重要な基準は、高タンパク質/ペプチド含有量、抽出溶媒への溶解性、均一性、安定性、CD毒性化合物との同等性、および測定技術への良好な応答である[95]。多くのプロラミン、主にグリアジン、およびグルテンのリファレンスは、独自のテストシステムで使用するためにさまざまな研究所や企業によって作成された。参照は、さまざまな手順によってさまざまなソースから分離され、タンパク質の含有量と組成はほとんど比較できなかった。その結果、同じ分析メソッドを使用した場合、ほとんどのリファレンスで検量線が発散した。例として、図4.7は、同じ抗原抗体反応における5つの市販のグリアジンリファレンスの異なる検量線を示している[105]。 Schwalbとその同僚による別の研究[106]では、4つの市販レファレンスである2つのグリアジンと2つの小麦グルテン製剤を、粗タンパク質の含有量（N×5.7）とオズボーン画分の比率について比較した。粗タンパク質の含有量は、グリアジンレファレンスで78.4％と91.9％、グルテンレファレンスでそれぞれ71.0％と77.0％であった。アルブミン/グロブリンの比率はかなり類似していたが（2.8-8.8％）、グリアジンの比率は30.7％から71.6％と非常に異なっていた（図4.8）。驚いたことに、両方のグリアジン製剤は、アルコール不溶性グルテニンを高い割合で含んでいた（25.4％と63.8％）。グルテンレファレンスは完全に異なる組成を示した。最初のものは35.9％のグリアジンと61.3％のグルテニンを含んでいたが、2番目のものは56.5％のグリアジンと34.7％のグルテニンで構成されていた。グルテン含有量（=グリアジン+グルテニン）に関しては、サンプルは同等で、91.2％と97.2％であった。したがって、市場で入手可能なタンパク質リファレンスは、粗タンパク質含有量とオズボーン画分の比率に大きな違いがあることを示している。したがって、キャリブレーションに使用されるリファレンスは、後続の分析手順で決定されるターゲットタンパク質について分析する必要がある。

 

ドラフト改訂コーデックス標準文書ALINORM97 / 26（1997）は、厳密に標準化された条件下で1つの研究所がゴールドスタンダードを作成することを推奨している。 このアドバイスを考慮して、プロラミン分析および毒性に関する作業部会（PWG）は、集合的に使用するためのグリアジンレファレンス（PWG-グリアジン）の準備を組織することを決定した[107]。 ヨーロッパの28品種の小麦の穀物を組み合わせて製粉し、得られた小麦粉を脱脂し、0.4 mol / LのNaClと60％エタノールで段階的に抽出した。 グリアジン抽出物を脱塩し、凍結乾燥し、均質化した。 得られたレファレンスは均質であり、60％エタノールに完全に溶解した。 粗タンパク質含有量（N×5.7）は89.4％で、グリアジン以外に3％のアルブミンとグロブリンしか存在しなかった。部分的に加水分解されたグルテン（サワードウ、スターチシロップ、麦芽抽出物、ビールなど）の定量に適したリファレンスを作成するために、小麦、ライ麦、大麦のプロラミン画分をペプシンとトリプシン、またはペプシンとキモトリプシンで消化した[108]。6つの異なる消化物を逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）とSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）で比較したところ、無傷のタンパク質が消化物に存在しなくなったことがわかった。キャリブレーションの基本パラメータとして重要な粗ペプチド含有量（N×5.7）は、穀物の種類に応じて65.7％から96.0％の間で変動した。発酵飲料の分析は、酵素消化物と競合ELISAの組み合わせが、発酵製品中のグルテンペプチドの定量に適切なシステムであることを示した。

 

結論として、リファレンスの構造と組成は、ターゲット分析物のものと可能な限り類似している必要がある。プロラミン含有量は、プロラミンキャリブレータを使用して決定する必要がある； グルテン含有量とはプロラミンとグルテリンの適切な混合物を使用する。 場合によっては、特別なレファレンスを使用することを薦める（たとえば、大麦汚染のためのホルデイン調製物または発酵製品のための部分的に加水分解されたレファランス）。 検量線は、物質の量ではなく、常にタンパク質/ペプチドの含有量に基づいている必要がある。 全体として、プロラミンだけでなく、グルテリンやグルテンペプチドについても一般的に受け入れられている標準物質の開発は、さまざまなグルテン定量技術の結果を評価、検証、比較するための共通のプラットフォームを提供するため、不可欠である。

 

 4.3　 免疫化学的方法

これまで、免疫化学的アッセイはグルテン分析に最適な方法であり[95]、Codex Stan 118-1979およびCodex Stan 234-1999で推奨されている。イムノアッセイは、抗体（免疫グロブリン）と、測定される物質である抗原との特異的反応に基づいている。抗体含有抗血清は、対応する抗原の注射による動物（例えば、ウサギまたはマウス）の免疫化によって産生される。次に、得られた抗血清の特異性をテストし、精製して望ましくない特異性を除去する。得られたポリクローナル抗体（pAbs）は、抗原のさまざまな結合部位（エピトープ）と反応する。グルテン定量の場合、pAbで分析した後に得られた結果は、穀物の種や品種の違いによる影響が少ない。ただし、この方法の欠点は、無毒の穀物のタンパク質と交差反応するリスクが高いことである。さらに、pAbは再現性のある組成と特異性で生成することはできない。より特異的なmAbは、免疫化後、単離された脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマと呼ばれるハイブリッド細胞を産生することによって産生される。次に、抗原に対する抗体が陽性であるこれらのハイブリドーマをクローン化し、細胞培養培地で増殖させる。結果として得られたmAb調製物は、沈殿および/またはアフィニティークロマトグラフィーによって精製できる。 mAbの利点には、特異性の絶対的な再現性とほぼ無制限の量を生成する能力が含まれる。イムノアッセイの中心的なポイントは、抗体/抗原複合体の定量である。以前は、沈殿物の形成またはマーカー（例えば、発光または蛍光色素、安定ラジカル、放射性同位元素）による標識が測定に使用されていた。今日、ELISAは最も頻繁に使用される技術であり、通常、グルテンの免疫化学的定量に適用される。最近では、免疫センサーが開発された。

 

4.3.1　ELISA

ELISAは比較的簡単に実行でき、他の手法よりも安価であることが多く、迅速な結果が得られる。使用される最も一般的なインジケーター酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（基質2,2'-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸））、アルカリホスファターゼ（基質4-ニトロフェニルホスフェート）、およびβ-D-ガラクトシダーゼ（基質4-ニトロフェニル- β-ガラクトシド）である。これらの酵素は、共有結合によって（例えば、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドとの反応によって）抗原に結合する。グルテン分析には、サンドイッチELISAと競合ELISAの2つのELISAシステムが最も頻繁に適用されている[95]。サンドイッチELISAの原理を図4.9（A）に示した。サンドイッチELISAでは、mAbまたはpAbをマイクロタイタープレートのウェルに固定化する。測定する抗原を含む抽出物のアリコートを加え、マイクロタイタープレートでインキュベートすると、抗体/抗原複合体が形成される（ステップ1）。洗浄後、インジケーター酵素で標識されたmAbまたはpAbが添加され、後続のインキュベーションステップ（ステップ2）中に抗原の2番目の結合部位に結合される。したがって、抗原は、支持体に結合した非標識抗体と酵素標識抗体の間に「挟まれ」る。結合していない酵素標識抗体を洗い流した後、酵素の基質を加え、着色された最終産物に変換し、分光光度法で測定する（ステップ3）。測定された吸光度は、抽出物中の抗原濃度に正比例します。これは、参照タンパク質と検量線を使用して計算できる。「サンドイッチELISAは、大きな抗原（タンパク質）にのみ適している。これは、抗原が、支持体結合抗体と酵素標識抗体の両方に結合するために空間的に分離された少なくとも2つの結合エピトープを持っている必要があるためである。グルテン分析の場合、サワードウ製品、麦芽抽出物、ビールなどの部分的に加水分解された（発酵）製品を分析する必要がある場合、グルテンペプチドには結合部位が1つしか残っていない可能性があるため、サンドイッチELISAは不適切である。 図4.9さまざまなELISAフォーマット：（A）サンドイッチELISA; （B）競合ELISA。参考文献から引用[95]。 競合ELISAは、インタクトなタンパク質だけでなく、抗原性エピトープが1つしかない小さなサイズの抗原（ペプチド）にも適している。このアッセイは3つの要素で構成されている（図4.9（B））[95]： 1.マイクロタイタープレートに固定化された抗原。 2.限られた一定量の酵素標識抗体。 3.抽出物からの抗原。標識された抗体とサンプル抗原がマイクロタイタープレートに追加され、遊離抗原と固定化抗原が抗体結合部位をめぐって競合する。添加するサンプル抗原の量が多いほど、固定化された抗原に結合する標識抗体の量は少なくなる（ステップ1）。結合していない標識抗体は洗い流され、酵素基質が添加されて着色された最終生成物に変換され、分光光度法で測定される（ステップ2）。抽出抗原の量が多いほど、酵素標識抗体によって生成される色は薄くなる。レファレンスタンパク質またはペプチドを使用して作成された検量線により、サンプル抗原の定量が可能になる。 グルテンを定量するための多数のELISAシステムが、さまざまな研究グループや企業によって開発されている。段階的な進歩は、Denery-Papini et al., [94]とヴィーザー[95] によって要約されている。ELISA検出法の精度の評価は、Diaz-AmigoとPoeppingによって提示されている[109]。適切なイムノアッセイを作成するための試行回数が多いため、現在市販されているELISAキットの原理のみをここで説明する（表4.2）。市場で最も古いイムノアッセイは、1990年にSkerritt and Hillによって開発された[99]。このサンドイッチELISAは、熱安定性ω-グリアジンに対してmAb（401.21）を使用する。この試験は、あらゆる種類の未調理および熱処理食品中のグルテンの定量に適していることが示唆されている。オーストラリアの小麦栽培品種Timgalenから40％エタノールで抽出されたグリアジン調製物がレファレンスタンパク質として提供されている。このアッセイは、共同研究での評価に成功し、公式分析化学者協会（AOAC International）によって検証され、いくつかの企業によって特許が取得され、販売されている。さまざまなテストキットのメーカーが示す感度は、20mgから160mgのグルテン/ kgの範囲である。このアッセイの主な欠点は、オオムギとオーツ麦のプロラミンの認識が非常に悪いことと、総グリアジンの約7％から20％の範囲のω-グリアジンの比率が異なるため、結果が品種に強く依存することである[97]。家庭での使用またはプロセスの品質管理に適した2番目の迅速検査キットは、迅速な定性的または半定量的結果を提供し、CD患者のGFDへの準拠を改善するために開発された[110]。マドリッドのメンデスグループは、ω-セカリンに対して生成され、プロラミンのCD毒性配列で発生するQQPFP、QQQFP、LQPFP、QLPFPなどのエピトープに対して向けられたmAb（R5）に基づくサンドイッチELISAを開発した[111]。 R5抗体は、グルテリンとの反応が非常に限られており、オーツ麦タンパク質との反応はない。最初のデータは、R5 ELISAが小麦、ライ麦、大麦のプロラミンを同程度に認識することを示した[111]。最近のデータは、R5 mAbがグリアジンと比較してセカリンおよびホルデインに対してより高い反応性を有することを示唆しており、したがって、グリアジン参照をキャリブレーションに使用すると、それらの含有量が過大評価される [108,112]。ホルデイン内では、2つのサンドイッチELISAキットの応答は、B-、γ-、D-、またはC-ホルデインのいずれかが濃縮されたホルデイン画分に応じて大幅に異なった[113]。 R5 mAbを使用するいくつかの異なるテストキットが現在市場に出ており、ほとんどのシステムは、van Eckert et alによって記述されたレファレンスグリアジン（PWG-グリアジン）に適合している。 [107]。 60％エタノールまたはカクテルの2つの抽出方法が提案されている（セクション4.1を参照）。サンドイッチR5ELISAは、共同研究 [114,115]、2005年にコーデックス分析およびサンプリング方法委員会（CCMAS）によってタイプIの方法として承認され、コーデックススタン118-1979およびコーデックススタン234-1999によって推奨され、AACCI承認メソッド38-50.01として承認された。このアッセイでは、1.5mgグリアジン/ kgの検出限界（LOD）と2.5mgグリアジン/ kgの定量限界（LOQ）が保証されてる。テストを簡素化および高速化するために、R5mAbが固定化されたスティックを含むキットが開発された[116]。サンプルに対応するプロラミンが含まれている場合、スティックは希釈されたサンプル抽出物に浸され、赤い線が表示される。このアッセイの感度は、約10mgグルテン/ kg製品である。テーブルや機械などの環境でグルテン汚染をチェックするための綿棒として特に適している。2012年に、R5mAbを使用した競合ELISAが開発された[117]。このテストでは、結合に1つのエピトープのみが必要であり、部分的に加水分解されたプロラミンに由来する小さなペプチド、たとえばサワードウ製品、麦芽抽出物、ビールなどの発酵穀物食品に存在するペプチドも検出できる。さらに、競合システムは、抗体が1つだけ使用され、サンプルとコンジュゲート抗体のインキュベーションがアッセイ内の1つのステップで実行されるため、サンドイッチシステムよりも安価で高速である。第1世代ELISAのキャリブレーターは、シーケンスQQPFPの合成ペプチドであり、第2世代ELISAのキャリブレーターは、小麦、ライ麦、および大麦のプロラミンからの消化性トリプシン加水分解物の混合物だった。 LODは1.4mgプロラミン/ kgである。競合R5ELISAと参照としてのプロラミン加水分解物の組み合わせは、発酵製品中の少量のプロラミンペプチドの定量に適していることが示された[108]。共同研究が成功したことにより、このメソッドはAACCI承認メソッド38-55.01として承認された [118]。競合するR5ELISAの欠点は、エタノールとのみ互換性があり、カクテルとは互換性がないことである。ただし、Mena et al.,は競合ELISAは、あらゆる種類の食品サンプルの分析に抽出溶媒UPEXと組み合わせて使用​​できることを実証した[104]。

G12およびA1という名前の2つのmAbは、α2-グリアジンの33 merペプチドに対して生成され、サンドイッチおよび競合ELISAの開発に使用された[119,120]。 33-merペプチドに対するG12の親和性は、A1よりも優れていることが示されたが、グルテン検出の感度はA1の方が高かった。サンドイッチELISAには、酵素標識抗体としてG12が含まれ、支持体結合抗体としてA1が含まれている。競合ELISAにはG12のみが含まれている。アッセイは、還元剤を含む抽出溶媒を提供するため、非加熱製品と熱処理製品の両方の分析が可能である。グルテンとPWG-グリアジンは、キャリブレーションのレファレンスタンパク質として機能する。サンドイッチELISAと競合ELISAはどちらも、小麦、ライ麦、大麦のプロラミンのLOD（limit of detection）が2mgグルテン/ kgおよび4mgグルテン/ kgのLOQ(limit of quantitation)を示す。オーツ麦プロラミンの検出限界ははるかに高い。無毒な穀物のタンパク質に対する交差反応性は観察されていない。 G12 / A1サンドイッチELISAの共同研究が最近行われ、この方法は2014年に承認された方法38-52.01としてAACCIによって承認される予定である。 EuroProxima（Arnheim、The Netherlands）と協力して、ライデン大学医療センター（Leiden、The Netherlands）は、RPQQPY [121]の配列を含むα20-グリアジンのエピトープを検出するモノクローナル抗体に基づいて、Gluten-Tec®という名前の競合ELISAを開発した。このアッセイでは、還元剤として60％エタノールとジチオスレイトールを含む抽出溶媒を使用するため、未加熱および加熱処理された食品の抽出が可能である。 α20抗体は、小麦およびライ麦のプロラミンに対して同等の反応性を示すが、大麦のプロラミンに対してはわずかに低下した反応性を示す。この抗体は、オーツ麦に対する感受性がはるかに低く、米、トウモロコシ、その他の無毒な穀物のタンパク質と交差反応しない。 Gluten-Tec®ELISAは、合成ペプチドGPFRPQQPYPBで校正する。 ngペプチド/ kg食品で得られた結果は、それぞれmgプロラミンとmgグルテン/ kg食品に変換する必要がある。共同研究により、サンドイッチR5ELISAで得られたものと同様の再現性が明らかになった[122]。 ngペプチド/ gからngグリアジン/ gへの100の変換係数は、小麦粉をスパイク(

加えた )したコーンブレッドサンプルの分析によって実験的に決定された。平均LODは、それぞれ0.41ngペプチド/ ml（エタノール抽出）および0.46ngペプチド/ ml（ジチオスレイトール抽出）だった。ペプチド濃度（ng / ml）は、100の係数を掛けることにより、サンプル中のペプチド濃度（ng / g）に変換される。ペプチドの量とグリアジン含有量の相関に基づいて、ngペプチド/ gからの変換係数〜ngグリアジン/ gは100である。結果のLODは2.5mgグリアジン/ kgである。将来の実験では、ペプチドとグルテンの間の変換係数を異なるマトリックスのサンプルに転送できることを実証する必要がある。

 

4.3.2 免疫センサー

Nassefらによって開発された免疫センサー[123]は、免疫優勢CDエピトープα56-75に対して産生された抗体と、捕捉抗体を固定するためにジチオール化合物を使用する化学的表面に基づいている。この免疫センサーに基づく方法は、高感度で再現性があることが示された。市販のグルテンフリーおよびグルテン含有の生および加工食品の分析に適用すると、抗グリアジンpAbに基づく以前に開発されたELISAと比較した場合、優れた相関関係が達成された。天然および前処理された食品サンプル中のグリアジンまたは小さなグリアジンフラグメントを定量するための電気化学的磁気免疫センサーは、Laube et al.,によって説明されている[124]。免疫学的反応は、トシル活性化ビーズ上へのグリアジン抗原の配向共有結合固定化による固体支持体としての磁性ビーズ上で実施された。グルテンフリー製品の法律に従って優れた検出限界が達成され、スパイクされたグルテンフリー食品を使用してアッセイが正常に評価された。

 

 4.4　非免疫化学的方法

 4.4.1 ポリメラーゼ連鎖反応

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特定のデオキシリボ核酸（DNA）フラグメントの測定に基づいている。 DNA分析は、タンパク質分析よりも数桁感度が高くなっている。任意のDNA配列のいくつかの分子は、非常に短時間で106〜108倍に増幅できる。 DNAはタンパク質よりもかなり熱安定性が高いため、PCRは非加熱製品と熱処理製品の両方に適用できる。 PCRは、DNAポリメラーゼによって触媒される増幅反応でプライマーとして機能する2つのオリゴヌクレオチドに隣接する特定のDNAフラグメントの増幅を可能にする。増幅産物は、ゲル電気泳動後、蛍光色素、キャピラリー電気泳動、またはサザンブロッティング（定性的PCR）によって視覚化される。定量的PCRには、蛍光マーカーまたは酵素マーカーで標識されたオリゴデオキシヌクレオチドが使用され、蛍光または色の強度を測定することによって定量が実行できる（「リアルタイム」PCR）。 BerneのAllmannのグループは、グルテン分析にPCRを適用した最初のグループだった。非常に反復的で特異的なゲノムコムギDNAセグメントが、コムギの検出に適用された[125]。この定性分析は、ベーカリー添加物から加熱および加工製品に至るまで、35の異なる食品サンプルでテストされた。グリアジン含有量が少なくても小麦澱粉は強く反応したが、添加剤として使用した小麦グルテンは検出できなかった。 PCRとサンドイッチELISAは、小麦をスパイクしたオーツ麦サンプルの分析によって比較された[126]。結果は、PCRがELISAシステムよりも約10倍感度が高いことを示した。 特定のプライマーペア（WBR11 / WBR13）を使用して小麦、ライ麦、大麦の汚染を検出するために、定量的で競合的なPCRシステムが開発された[127]。内部DNA標準は、元のPCR産物に20塩基対を追加することによって構築された。 PCRシステムは、グルテンフリーとラベル付けされた15の市販製品に適用され、サンドイッチELISAと比較された。どちらの方法でも、ほとんどのサンプルで同じ結果が得られ、グルテンフリー製品のテストで相互にサポートすることが提案された。プライマーペアは、定量PCRシステムでも使用され、グルテンフリーと指定された粉の4つのサンプルとビスケットの13のサンプルで微量のグルテンを検出した[128]。融解曲線分析を使用したリアルタイムPCRは、食品サンプル中の小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦の汚染を識別するために特別に確立された[129]。PCRとサンドイッチELISAの同時分析は良好な相関関係を示した。ゲル電気泳動よりも融解曲線分析を使用する利点は、増幅に使用したのと同じクローズドキャピラリーで分析を実行できることである。したがって、サンプルの相互汚染のリスクを排除することができる。 Henterich et al., によって、グリアジン検出のためにワンステップのリアルタイム免疫PCRが導入された[130]。この手法では、R5モノクローナル抗体をオリゴヌクレオチドと結合させた。グリアジン分析の感度は、ELISAで到達したレベルよりも30倍以上増加した。小麦、ライ麦、大麦のDNAを測定するための3つの異なるリアルタイムPCRシステムが、Mujicoのグループによって開発された[131,132]。これらのシステムの組み合わせにより、穀物の種類の識別と、汚染されたオーツ麦サンプル中の小麦、ライ麦、大麦の割合の決定の両方が可能になった。コーンスターチと非加熱食品サンプルの分析に使用されたPCRとR5ELISAの比較により、良好な線形相関が明らかになった [133]。リアルタイムPCR法の実用性は、49の食品サンプルの分析によってテストされた。 49サンプルのうち3サンプルはPCRとELISAの両方でグルテン陽性であり、1サンプルはPCRでのみ陽性であることがわかった[134]。 HMW-GSをコードする相同標的配列を含むリアルタイムPCRアッセイを使用して、さまざまな小麦種（一般的な小麦、スペルト小麦、カムット）、大麦、およびライ麦を検出した[135]。システムの感度はマトリックス（共雑分）に依存し、2.5mg小麦/ kg（野菜マトリックス）から5.0 mg / kg（肉マトリックス）の範囲であった。オーツ麦と大麦に固有のシステムでは、10 mg / kgの感度が得られた。グルテンフリー食品中の小麦汚染を定量化するための高感度リアルタイムPCRシステムは、Mujicoとその同僚によって開発および最適化された[136]。さまざまな製品の分析により、R5ELISAと比較してPCR技術の感度が高いことが示された。 要約すると、開発された定量PCRシステムは、小麦、ライ麦、大麦の存在に対する高感度のスクリーニングツールとして推奨できる。それは免疫学的方法を補完するものと見なすことができる。ただし、PCRはタンパク質ではなくDNAを検出することを覚えておく必要がある。小麦、ライ麦、大麦のPCRスクリーニング実験で陽性のサンプルは、グルテンタンパク質を対象とした分析方法で再分析する必要がある。 PCRは、ビール、シロップ、麦芽抽出物などの部分的に加水分解された製品中のグルテンや、添加剤として使用される重要な小麦グルテンの検出と定量にも適していない。

 

4.4.2 電気泳動

電気泳動によるタンパク質の分離は、荷電アミノ酸残基の数の違いによって引き起こされる電場の異なる移動度に基づいている。穀物の分野での電気泳動の応用は、タンパク質（ペプチドではない）と定性的特性評価（定量ではない）に焦点を合わせてきた。穀物タンパク質の電気泳動は、主にデンプンゲルでの移動境界電気泳動の使用から始まった。その後、これはPAGEに置き換えられ、はるかに優れた分離が提供された。分離後のさまざまな検出方法が開発されており、クマシーブルーとシルバーが最も一般的に適用される染色剤である。重要な電気泳動原理は酸（A-）PAGEである。これは、低pHでのタンパク質の電荷密度の違いに基づいており、主にフィンガープリント、特に栽培品種の分化と同定に関する研究でのプロラミンのフィンガープリントに使用される。ゲル上での移動度の増加に応じて、グリアジンはω-、γ-、β-、およびα-グリアジンに分類され、セカリンはω-およびγ-セカリンに分類された。しかしながら、アミノ酸配列に関するその後の研究は、電気泳動移動度に基づく分類が、アミノ酸配列に基づく「真の」分類と常に一致するとは限らないことを示した。たとえば、配列分析に基づいて、α-およびβ-グリアジンは1つのグループに分類される。 従来のキャピラリー電気泳動は、電荷とサイズの違いに応じてタンパク質を分離する。分析物は、電界により導電性媒体で満たされた小さなキャピラリーの内部を移動し、溶出後のUV吸光度またはレーザー誘起蛍光によって検出できる。 SDS-PAGEの原理は、分子サイズ（質量）のみに依存して、タンパク質が電場で分離されるように、過剰な負に帯電したドデシル硫酸アニオンでタンパク質を覆うことに基づいている。 D-、C-、B-、A-ホルデイン、HMW-GS、LMW-GS、単一のHMW-GSなど、SDS-PAGEの移動度に応じて名前が付けられている穀物タンパク質もある（例：1〜12番）。ここで、SDS-PAGEでの見かけの分子量は、アミノ酸配列に由来する真の質量よりもはるかに高い（+ 10％以上）と推定されていることに注意すること。 A-PAGEまたはSDS-PAGEで分離されたタンパク質は、抗体との反応により特異的に検出できる。タンパク質は、電流を使用して、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデンで作られたメンブレンに転写されます（いわゆるウエスタンブロッティング）。その後、検出可能な標識を含むタンパク質特異的抗体（例えば、ELISA技術と同様のレポーター酵素）が追加される。ラベルと適切な基板の間の反応により、目に見える生成物が生成される。 等電点電気泳動（IEF）の手法は、タンパク質のさまざまな等電点に基づいているため、固定化pH勾配ゲルで分離できる。 IEF（一次元）は、二次元（2D-）ゲル電気泳動のためにSDS-PAGE（二次元）と組み合わせて頻繁に使用される。 2D電気泳動は、タンパク質の最も効果的な分離方法の1つである。たとえば、小麦粉タンパク質は数百のスポットに分離できる（図2.3）。プロテオミクスの分野では、2Dゲル電気泳動によって分離されたタンパク質は、質量分析（MS）ペプチドマッピングおよびデータベース検索アルゴリズム（手順）によるトリプシン消化後に同定できる。 プロテオミクスは、CD研究で頻繁に使用される。たとえば、腸組織に固有のタンパク質発現を特定したり、体液中の診断バイオマーカーを決定したり、細胞プロセスの最終産物のフィンガープリントを作成したりする[137,138]。

 

4.4.3  カラムクロマトグラフィー

 

カラムクロマトグラフィーは、穀物タンパク質の特性評価、分離、および定量に広く使用されている。 特に、ゲル浸透（GP-）液体クロマトグラフィー（分子量に基づいて分離）「およびサイズ」および逆相（RP-）液体クロマトグラフィー（疎水性に基づいて分離）は1980年代から適用されてきたが、陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィーは過去数十年の間に重要性を失っている。特別な場合には、アフィニティークロマトグラフィーが適用されている。これは、非常に特異的な相互作用（たとえば、抗原と抗体、酵素と基質、または受容体とリガンドの間）に基づく方法である。カラム材料の改良により、HPLCの適用が可能になり、分離効率が向上し、溶出時間が大幅に短縮された[139]。溶出したタンパク質の検出と定量は、200〜220nmの範囲のUV吸光度を測定することによって実行される。これらの波長では、吸光度の単位はタンパク質の種類に関係なくタンパク質の量と高い相関があり、検出限界は約1〜2μgのタンパク質である[140]。 GP-およびRP-HPLCは、適切なカラム材料が使用されている場合、ペプチド混合物の分離および定量にも使用できる。重要な欠点は、検出技術がグルテンタンパク質と非グルテンタンパク質を区別できないため、非特異的であり、複雑な食品の分析には適用できないことである。ただし、特別な場合には、カラムクロマトグラフィーをグルテン測定に適用できる。 この制限にもかかわらず、カラムクロマトグラフィー、特にRP-HPLCは、CD研究において非常に価値のある支援である。たとえば、グルテン分析に必要な標準物質の特性評価、CDの病態メカニズムに関与するタンパク質とペプチドの分離と同定、およびタンパク質とペプチドの代謝のフォローアップに頻繁に使用されている。また、植物育種や遺伝子工学の追跡にも適用できる。さらに、液体クロマトグラフィーと質量分析（LC-MS）の組み合わせは、今日、高い特異性と感度でタンパク質とペプチドを同定および定量するために不可欠な機器である。 GP-HPLCは、グルテンフリーのパン製造のベース材料として広く使用されている小麦デンプンのグリアジンとグルテンの両方の測定に適用できる[22]。さまざまな会社から提供された23のデンプンサンプルを、60％エタノール（グリアジン）または50％2-プロパノールと還元剤（グルテン）のいずれかで抽出した。抽出物を真空遠心分離機で濃縮し、GP-HPLCで分析した。結果は、15〜574 mg / kgデンプンの広範囲のグリアジン濃度を示した。 2回の測定から得られた平均変動係数は±2.6％であった。グリアジンの含有量と粗タンパク質の相関係数（N×5.7）はr = 0.232であった（図4.2）。これは、粗タンパク質の含有量がコーデックス委員会の最初のドラフトで想定されているグリアジンの含有量を反映していないことを示している（セクション3.1を参照）。グリアジンとグルテニンの比率（後者はグルテンからグリアジンを差し引いて計算）を考慮すると、大きな違いが見られ（0.2-4.9）（図4.10）、グルテンのプロラミン含有量が50％であるという一般的な仮定を示している点（Codex Stan 118 -1979）は正当化されない。この発見は、さまざまな小麦種、ライ麦、大麦、およびオート麦の栽培品種からのプロラミンおよびグルテリンのRP-HPLC分析によって確認された[141]。比率は1.4から13.9の範囲であった（図4.10）。したがって、プロラミン含有量に2の係数を掛けることによって計算されたグルテン含有量は、部分的にかなり過大評価されている。グルテンフリー製品の製造に使用される他のいくつかの原材料は、GP-HPLC法によってテストされた。プロラミンとグルテンの測定は、原則として、リンゴ繊維、そば粉、スパイス混合物、栗粉、キビ粉、米粉では可能でしたが、脱脂乳粉とコーンフラワーでは不可能であった[22]。

 

4.4.4  質量分析

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）は、タンパク質およびペプチドの分子量を決定するための重要な方法になっている。この手法の原理は、短いレーザーパルスによって高真空中で分析物マトリックス共結晶化物からイオンが生成されることである。レーザーによって放出されたイオンは、短い高電圧インパルスによってTOFMS機器に加速される。重いイオンは軽いイオンよりも遅いため、飛行時間は分析対象物の質量電荷比（m / z）に比例する。キャリブレーションは既知の質量の分析物を使用して実行され、電界を反射体として使用してイオンの飛行経路を2倍にすることで分解能が向上する。 MALDI-TOF MSを使用すると、数分以内に低ピコモル範囲のクロマトグラフィー精製を行わなくても、約1000〜100,000の質量を同時に測定できる。したがって、インタクトなタンパク質だけでなく、タンパク質加水分解物も分析することができる。 マドリッドのメンデスのグループは、さまざまな穀物からのプロラミンの同定にMALDI-TOFMSを最初に使用した[142]。サンプル前処理は非常に簡単であることが示され、タンパク質抽出に還元剤を使用しても分析が妨げられることはなかった。 30の食品サンプル（小麦パンとデンプン、グルテンフリー食品）は、MALDI-TOFMSと実験室で作られたサンドイッチELISAによって同時に分析された[143]。 MSの結果は、4〜100mgグリアジン/ kg製品の範囲で線形応答を示し、ELISAの応答との良好な相関関係を示した。グリアジン、セカリン、ホルデイン、およびアベニンは、複雑な食品マトリックス（共雑物質）に同時に存在する場合でも、MALDI-TOFMSで選択的に区別できる[144,145]。 Iamettiのグループは、MALDI-TOF MSを使用して、サンドイッチELISAでは検出できなかった多くのビール中のグルテン由来ペプチドの特性を明らかにした[146,147]。さまざまな国で生産されたビールは、ペプチドプロファイルが大きく異なり、最も関連性の高い違いは、低質量領域（<5000）で見つかった。液体クロマトグラフィー（LC）とQ-TOF MSを組み合わせた組み合わせ技術を適用して、トリプシンで消化した後のグルテン含有およびグルテンフリーの原材料から作られたビールを分析した[148]。 ELISAによる補足分析は、MSで検出可能なグルテンを含むいくつかのサンプルがELISAで低い応答しか示さなかったことを示した。グルテン源（小麦や大麦など）は特定できたが、適用されたMS技術ではグルテン含有量の定量データを提供できなかった。 2010年に、LC-MS / MSは、ネイティブおよび加工食品サンプル中の小麦グルテンペプチドの定量のために開発された[149]。サンプルをペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンで消化し、6つの免疫原性グルテンマーカーペプチドに基づくLC-MS / MSで分析した。このメソッドは、0.01〜100mgペプチド/ kg製品の範囲でこれらのマーカーペプチドを検出した。ただし、6つのマーカーペプチドの非常に異なる比率がさまざまな食品で見つかった。「グルテン含有量は不可能に見え、試みられなかった。 同様に、60種類のビールの平均ホルデイン含有量のパーセンテージとして表される相対値のみが、トリプシン消化の有無にかかわらずペプチドのLC-MS分析後に計算できた。 タンパク質ごとに少なくとも2つのペプチドがマーカーとして選択され、マルチプルリアクションモニタリング（MRM）モードで定量化され、ビール中のホルデインの検出が可能になった[150]。 全体として、質量分析はグルテンタンパク質およびペプチドの検出のための非常に価値のある非免疫学的アプローチである。 ただし、コーデックス委員会やその他の規制で要求されているように、取得したデータをmgグルテン/ kg製品に変換することはまだできてない。 さらに、それが必要とする高価な機器と専門知識は、この技術の使用を専門のサービス研究所と大手食品メーカーに制限している。