複雑な病気セリアック病５
6.3 免疫応答
進化の過程で病原体と戦うために徐々に構築される人間の免疫システムには、先天性（自然）免疫のメカニズムと適応免疫のメカニズムの両方が関係している。高速自然免疫系は、原始的な多細胞生物の非常に早い時期に発達し、哺乳動物で副次的機能を担うために複雑さを徐々に獲得した：特異性が低く記憶がないにもかかわらず即時の障害に対する役割と、MHC(Major histocompatibility complex,主要組織適合遺伝子複合体分子)分子（299）を介した適応免疫メカニズムに対する抗原提示の２番目の役割がある。遅い適応システムは、脊椎動物でずっと後に出現し、BおよびTリンパ球に依存して、長期記憶を備えた遅延しているが非常に特異的な応答を可能にする。
腸関連リンパ組織（GALT）は、免疫系の最大でおそらく最も複雑な部分である[300]。 400m2の表面上で外来抗原の複雑な混合物と連続的に接触している。 GALTは、病原性微生物と食物化合物などの無害な抗原を区別する必要がある。したがって、特定のシグナルが炎症反応を引き起こさない限り、腸管免疫のデフォルト設定（初期設定）は耐性の生成である。腸粘膜に損傷を引き起こすCDの免疫学的メカニズムは複雑であり、多数の免疫担当細胞と免疫学的メディエーター（仲介者）が関与する反応を構成する。 CDの適応免疫応答におけるグルテンペプチドの役割は十分に確立されている。自然免疫応答に関して、いくつかの未解決の問題が存在する。特に、自然免疫と適応免疫のコラボレーションはまだ不明のままである。しかし、適応応答と生得（自然）応答の両方がグルテンを含まない食事で軽減するという事実は、相互依存の可能性を探る方法を示唆している。
6.3.1 適応応答
HLA-DQ2 / 8対立遺伝子がCDの主要な遺伝的危険因子であることが発見されてから[301]、CDの病因において適応免疫応答が中心的な役割を果たすことが説得力をもって確立された。適応免疫は、主な遺伝因子（HLA-DQ2 / 8）と主な環境因子（グルテン）の間に議論の余地のないリンクを提供する。過去数十年間の数多くの研究が、グルテンペプチドに対する適応免疫応答の理解における重要な進歩に貢献した。固有層（基底膜）の免疫カスケードの主要なプレーヤーは、細胞レベルのAPC、T細胞、およびB細胞と、分子レベルのTG2、HLA-DQ2 / 8ヘテロダイマー、T細胞受容体（TCR）、サイトカイン、およびケモカインである（図1.10）。
6.3.1.1 トランスグルタミナーゼ
腸組織に存在するTG（Transglutaminase）は、CDの適応免疫応答に決定的に寄与する。 TG（タンパク質グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼ、EC 2.3.2.13）は、グルタミン側鎖（アシルドナー）から一級アミン（アシルアクセプター）へのアシル転移を触媒する酵素である。 TGの最も重要な生理学的機能は、グルタミン残基を含むタンパク質からリジン残基を含む別のタンパク質への共有結合的かつ不可逆的なアミド交換であり、ε-（γ-グルタミル）-リジンイソペプチド結合の形成をもたらす（図1.12（A ））[302]。多くの場合、機械的チャレンジとタンパク質分解に対して非常に耐性のある架橋生成物は、皮膚、髪、表皮の角質化、創傷治癒など、そのような特性が重要な多くの組織に蓄積する。さらに、TGは低分子量第一級アミンのタンパク質への取り込みにより、アミド交換反応を触媒する。特定の条件下で、特にリジンのε-アミノ基または他の一級アミノ基が利用できない場合、または比較的低いpH値では、グルタミンは水との反応によりグルタミン酸に脱アミド化される（図1.12（B））。
TGは、1959年にMycekと同僚によって、インスリンへのアミンの取り込みを触媒するモルモット肝臓の酵素として初めて報告された[303]。その後の多数の調査により、TGはすべての真核生物に遍在し、哺乳類では8つの異なるTG（TG1-7、第VIII因子）が検出されていることが示された。これらの異なるTGはすべて、触媒部位で共通のアミノ酸配列を共有し、類似した遺伝子構造を持っているが、別々の遺伝子によってコードされ、異なる基質特異性と機能を示す。それらの酵素活性はCa2 +依存性であり、グアノシン二リン酸および三リン酸（GDP / GTP）を含む他の因子も哺乳類TGのいくつかの活性に影響を与える。活性化すると、酵素は劇的なコンフォメーション変化を起こす。この変化では、C末端残基が1.2pmほど置換される[304]。
一般的に「組織トランスグルタミナーゼ」と呼ばれるTG2は、おそらくTGファミリーの最も遍在的かつ多機能なメンバーである[305]。 Wolfと同僚が開発した高感度のELISAにより、TG2の検出と定量が可能になった[306]。 TG2は、アシルトランスフェラーゼとして作用するほか、Gタンパク質、アダプタータンパク質、細胞表面接着メディエーター、ジスルフィドイソメラーゼ、およびセリン/スレオニンキナーゼとしても作用する[307]。 TG2活性の調節不全は、慢性変性疾患、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、または感染症などのいくつかの病的状態に関連している[308]。 CD患者の抗体の標的とする主要な自己抗原として同定されたため[113]、TG2はCDの病因と診断の調査において重要な役割を果たしてきた。
TG2は、687アミノ酸残基の単量体タンパク質で、分子量は約76,000である。 N末端βサンドイッチドメイン（残基1〜139）、α/β触媒コアドメイン（残基140〜460）、および2つのC末端βバレルドメイン（残基461〜それぞれ538および539-687）（図1.13）[305]。システイン（C）277、ヒスチジン（H）335、およびアスパラギン酸（D）358はアシル転移の活性部位を形成し、残基430-453はCa2 +結合部位を形成する。アミド交換またはアミド分解の最初のステップは、タンパク質/ペプチド結合グルタミン残基によるシステイン277の活性部位のアシル化で構成され、アンモニアの遊離とTG2と対応するタンパク質/ペプチド間のチオエステル中間体の形成をもたらす。アミド交換反応では、タンパク質結合リジン残基のε-アミノ基などの求核性一級アミノ基がチオエステル中間体に結合する。脱アミド化反応では、水はグルタミン残基からグルタミン酸残基への転換につながる求核剤である。 おそらく、CDに関与するグルテンペプチドは、ヒスタミンへの一次トランスアミド化を介して脱アミド化される可能性があり、その分泌はCD患者で増加する[309]。 TG2のさらなる特性は、GTP（guanosine triphosphates）に結合して加水分解する能力である。この活性はアシル転移活性とは無関係だが、GTPの結合はアシル転移触媒部位への基質結合を阻害する。
もともと、TG2は、通常の生理学的条件下では健康な細胞によって分泌されないサイトゾルでのみ見られる細胞内タンパク質と見なされていた。細胞のストレスまたは損傷のみが、酵素の細胞外マトリックスへの漏出を引き起こす可能性がある。より最近の研究では、TG2は通常の条件下で細胞外空間に分泌され、細胞外マトリックスの安定化とリモデリングに寄与することが示されている[310]。しかし、TG2が分泌されるメカニズムは未だ謎のままであり、「TG2の活性と炎症のどちらが先か？」という疑問が未解決のままである。細胞外環境に分泌されると、高Ca 2+および低GTPレベルは、閉じた不活性な立体構造を触媒活性に必要な開いた活性な立体構造に変換することにより、酵素の活性化を促進する。フィブロネクチン、コラーゲン、グルテンペプチドなど、多くのタンパク質およびペプチドが架橋の潜在的な基質である。
CDにおけるTG2の可能な役割を説明した最初の研究は、Bruceのグループによって公開された[311]。 対照と比較して、未治療および治療CD患者の空腸組織でTG2活性が増加し、グルタミンに富むグリアジンペプチドがTG2の優先的基質を表すことが示された。 次の多くの調査により、架橋と脱アミド化の両方が起こることが明らかになり、脱アミド化の生理学的重要性はCDとの関連でのみ確立された。 グルタミンは一般に主要なアミノ酸残基であるため、グルテンタンパク質およびペプチドはTG2の好ましい基質（アシル供与体）である。
CDの病原性カスケード（流れ、連鎖）では、脱アミド化とアミド交換の両方が重要とみなされる（図1.10のステップ3）。 第一に、TG2はグルテンペプチドの特定のグルタミン残基をdeamidatingが可能で、親和性を高めてHLA-DQ2 / 8分子に結合する修飾エピトープを作成する（以下を参照）。第二に、TG2はグルテンペプチドを、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質やそれ自体を含む他のタンパク質に架橋することができる。そのような架橋は、固有層におけるグルテンペプチドの蓄積を促進する（「ハプテンキャリアモデル」）。さらに、グルテンペプチドとTG2の結合体は、TGA（抗体）の産生を活性化する。適応免疫応答におけるTG2の中心的な役割により、その選択的阻害はCDの代替治療アプローチと見なされている。
グルタミン残基の脱アミド化は、特にHLA-DQ8ヘテロダイマーの場合にはCD4 + T細胞の刺激が絶対必要ではないが、HLA-DQ2 / 8へのペプチド結合には強く好ましい。 TG2による脱アミド化は、選択されたグルタミン残基にのみ特異的であり、標的グルタミンに隣接するアミノ酸に依存する。グルタミンに対するプロリンおよび疎水性アミノ酸の相対的な位置が重要であることは、合成ペプチドライブラリーによって実証されている[312,313]。配列QXPおよびQXXF（Xは任意のアミノ酸を表し、Q、Pはそれぞれグルタミン、プロリンで、Fは疎水性アミノ酸を表す）はTG2の好ましい基質として同定されているが、QPおよびQXXP配列では酵素は活性ではない。したがって、TG2による脱アミド化は、グルテンペプチドへの負の電荷の非常に選択的な導入をもたらす。これらの発見に基づいて、TG2認識アルゴリズム（手順）が設計され、特権TG2認識配列のさまざまな穀物タンパク質のデータベースをスクリーニングし、多くの脱アミド化感受性エピトープが小麦グリアジンとグルテニン、ライムギセカリン、大麦ホルデイン、オート麦アベニンで同定された。 TG2によって部分的に脱アミド化されたグルテンペプチドエピトープの例を表1.5に示した。
HLA-DQ分子によって制限されるグルテン感受性T細胞エピトープの包括的な新しい命名法がSollidと同僚によって提案された[314]。例は表1.5に含まれている。命名法は、次の3つの基準に基づいている。
１.エピトープに対する反応性は、少なくともある特異的T-細胞クローンによるものであること。
2.取り込まれるHLA-制限要因は不明確に定義されている必要がある。
3.エピトープの9アミノ酸コアは、短縮型ペプチドを用いた分析および/またはエピトープのリジンスキャンを用いたHLA結合または同等のやり方のいずれかによって定義されている必要がある。
専用のウェブサイト（http://www.isscd.net/EpitopeNomenclature.htm）は、より多くのエピトープが特定されたとそのリストを更新した。ただし、F-S（LMW-GS）、Y-Y（HMW-GS）、およびF-Q（α-グリアジン）間のペプチド結合など、消化管ペプチダーゼによるこのようなエピトープの切断は、これらの基準では考慮されない。たとえば、Juhazzらは、プロテオームベースのデータセット、CD関連エピトープのコレクション、およびin silico酵素消化により、小麦「Butte-86」のグルテンタンパク質のCDエピトープの数がネイティブの549から消化物中のタンパク質を99まで[315]減少したことを示した。
アミド分解のほかに、TG2はグルテンペプチドとそれ自体の間の架橋を触媒し、HMWコンジュゲートを形成する。共焦点顕微鏡による分析により、TG2は活性CDの上皮および上皮下レベルでグリアジンと共局在し、グリアジンは十二指腸粘膜のTG2に直接結合していることが示された[316]。
TG2とQLQPFPQPQLPY配列を持つ免疫原性グルテンペプチド（α57-68）の複合体の最初の化学的特性は、2004年にFleckensteinと同僚によって報告された[317]。 2種類の共有結合したコンジュゲートが検出された。ペプチドは（1）チオエステル結合を介してTG2の活性部位システインに、（2）イソペプチド結合を介してTG2の特定のリジン残基に結合した。理論的には、TG2はイソペプチド結合形成のために33リジン残基（K）とペプチドα57-684グルタミン残基（Q）を提供する。ペプチド配列内のQ65のみがイソペプチド結合に関与していることがわかった。 TG2内のリジン残基（K）の役割は、TG2とペプチドのモル比に依存することが示された。TG2 /ペプチド比1：1の比率で関与したのはK590のみであり、K562、K590、およびK600は1:10の比率で、K444、K562、K590、K600、K649、およびK677は1:50と 1：100で関与した。イソペプチド結合形成に関与するリジン残基はランダムに分布してはいなかった。 6残基中5残基は、触媒部位から遠く離れたC末端セクションIV（図1.13）にあった。 TG2とグルテンペプチド間のイソペプチド結合の形成は強く方向付けられていると結論付けることができる。
さまざまなグリアジンに対するTG2の触媒活性は、Dieterichらによって研究された [318]。 11個のα-、6個のγ-、3個のω1,2-グリアジン、および1個のω5-グリアジンをモノダンシルカダベリン（蛍光アシルアクセプター）およびTG2とともにインキュベートし、続いて増強された蛍光強度を測定した。結果は、テストされたすべてのグリアジンがTG2の良好な基質であることを示した。対照基質であるウシ血清アルブミンおよびラクトアルブミンでは、モノダンシルカダベリンの取り込みは検出されなかった。蛍光TG2活性アッセイを使用して、グリアジンペプチドα2（56-68）の反応性グルタミン（Q）としてのQ65の絶対要件は、TG2 /ペプチドコンジュゲートの形成によって確認された。これらのコンジュゲートのCD特異的関連性は、これらの架橋ネオエピトープに対する自己抗体の産生に由来する（以下を参照）。さらにTG2は、免疫原性グルテンペプチドが、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質に結合することを触媒する。このハプテン化とグルテンペプチドの長期固定化は、CDの腸炎の永続化に重要となる可能性がある[318]。
Dorumと同僚による研究の目的は、非常に不均一なタンパク質複合体、すなわち小麦グルテン中のTG2の好ましいペプチド基質を特定することであった[319]。グルテンをペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびカルボキシペプチダーゼで消化した後、TG2および一次アミノマーカー5-ビオチンアミドフェニルアミンとともにインキュベートした。ペプチド/アミン複合体には、ストレプトアビジンDynabeadsを加え、質量分析により同定した。 TG2の好ましい基質として、合計31の異なるグルテンペプチドが見つかった。驚くべきことに、これらのペプチドの大部分は既知のグルテンT細胞エピトープを含んでいた。 33-merペプチドは、同定されたTG2基質には含まれなかった。同じ研究では、4つのα-グリアジンペプチドと1つのγ-グリアジンペプチドが、アミド交換されたグルタミン残基と脱アミド化されたグルタミン残基の両方を持っていることが示された。たとえば、ペプチドα3-24はQ16で脱アミド化され、Q21でトランスアミド化された。
CDにおけるTG2の病原性の役割の理解における大きな進歩にもかかわらず、いくつかの問題が解明されていない[308]。これらには、TG2の細胞内調節、その外在化のメカニズム、TG2によるグルテン修飾の主要部位としての腸細胞の役割、TGA（Anti-transglutaminase antibody）の触媒活性への影響、および脱アミド化および架橋酵素と自己抗原としての2つの異なる免疫関連の関係が含まれる。
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