6.3.1.2  HLA-DQヘテロダイマー

HLA-DQ2および-DQ8対立遺伝子は、CDの原因遺伝子である。 DQ2およびDQ8ヘテロダイマーは、APC（Antigen-presenting cell,成熟樹状細胞、マクロファージ、B細胞）の細胞表面に発現するHLAクラスII分子である。対立遺伝子A1 ∗ 0501、0505、0201、03に対応するα鎖と、対立遺伝子B1 ∗ 0201、0202、0301、0302に対応するβ鎖の完全なアミノ酸配列（シグナル伝達ペプチドなし）は、図1.14である。見てわかるように、α鎖とβ鎖のそれぞれの中の異なるタンパク質は、高度の配列相同性を示している。 DQ2 A1 ∗ 0501および0505のα鎖は、シグナル伝達ペプチドの1つのアミノ酸残基を除いて同一である。

 

結合したα鎖とβ鎖は、「ペプチド溝」で免疫原性グルテンペプチドに結合し、固有層のT細胞に提示する。免疫原性脱アミド化グリアジンペプチドα57-68/ E65（QLQPFPQPELPY）との複合体におけるHLA-DQ2.5の結晶学により、DQ2.5分子のペプチドグルーブ内の結合機能に関する洞察が得られた（A1 ∗ 0501 / B1 ∗ 0201） 。ヘテロダイマーのN末端ドメインが結合して溝を形成する：α鎖からの5ターンのαヘリックスは、溝の側壁を形成するβ鎖からのより長いがねじれたαヘリックスと平行に走る（図1.15）[320]。ペプチドの11残基（L（ロイシン）58〜Y（チロシン）65）が実験電子密度マップではっきりと見えた。ペプチドの主鎖原子と DQ2.5の間に13の水素結合がある。DQ2.5およびペプチド側鎖アミドとDQ2.5間の4つの水素結合ある。後者は、このペプチドの9つのコア残基のうち4つが、アミド水素結合に関与できないプロリン残基（P60、P62、P64、P67）であるため、注目に値する。各主鎖の水素結合相互作用の相対的寄与は、一連のN-メチル化ペプチド類似体を調製することにより研究された[321]。結果は、フェニルアラニンF61およびグルタミンQ63の水素結合が結合に最も重要であるのに対し、グルタミン酸E65およびチロシンY68の水素結合は、全体的な結合親和性への寄与が小さいことを示した。

HLA-DQ2.5と-DQ2.2のペプチド結合特異性は類似しているが、DQ2.2にはp3に追加の結合ポケットがあり、セリン、スレオニン、アスパラギン酸が優先され、プロリンはこの位置で不利になっているようである[322]。さらに、DQ2.2と比較してDQ2.5のはるかに高い病気危険性は、DQ2.5 分子が免疫原性ペプチドにDQ2.2（数時間）よりずっと長い（数日間）結合であると言う事により示される [36]。DQ2.2のフェニルアラニンの位置α22でのDQ2.5のチロシンによる置換（図1.14）により、DQ2.5分子のペプチドカーゴをより長時間保持する能力が明らかに向上する。 HLA-DQ2と同様に、HLA-DQ8のペプチド結合溝は、負に帯電した残基とのペプチドの結合を促進する。機能的結合研究により、グルタミン酸のアンカー( つなぎ止め )位置position 1とposition 9、疎水性残基のposition 4が示唆された（表1.5）。グルテンペプチドQQYPSGEGSFQPSQENPQと複合体を形成したHLA-DQ8の結晶構造により、結合アンカーサイトposition 1およびposition 9で負に帯電した残基が優先されることが確認された。 1つのグルタミン酸残基のみを必要とするDQ2とは対照的に、DQ8への結合には2つのグルタミン酸残基が必要である。この制約は、DQ2陽性患者と比較して、DQ8陽性患者で活性のあるグルテンペプチドの数が少ないことを説明できる。

 

DQ8ヘテロダイマー（A1 ∗ 03 / B1 ∗ 0302）は、DQ2.5ヘテロダイマーと強い構造的類似性を持っている（図1.14）。それでも、バックボーン構造には2つの顕著な違いがある。まず、DQ8の位置α56に2番目のアルギニン残基（R）を挿入すると、この配列領域のαヘリックスストレッチの長さに影響する。第二に、DQ2.5のβ鎖はβ71位に正に帯電したリジン残基（L）を有し、これは免疫原性ペプチドの負に帯電したグルタミン酸の結合に重要である。 DQ8にはβ71にスレオニン（T）が含まれており、この領域には全体的に中性の静電ポテンシャルがある。この違いと一致して、エピトープα57-68/ E65がDQ8分子によって認識されることを示すデータはない[320]。

HLA-DQヘテロダイマーの組成とCDに進むリスクとの相関関係のモデルがTjonと同僚によって提示された[38]。したがって、APC（Antigen-presenting cell）によってT細胞に提示されるグルテンペプチドのレベルは、CDへの展開に重大な影響を及ぼす。まず、HLA-DQ2.5ホモ接合体の個体は、HLA-DQ2.5ヘテロ接合体の個体よりもCD発生のリスクが5倍高い。これは、HLA-DQ2.5ホモ接合体の非常に強力なT細胞応答およびIFN-γ産生と相関するが、ヘテロ接合体の個人ははるかに弱い応答を示す[35]。ホモ接合体とヘテロ接合体のヘテロダイマーは、β鎖の1アミノ酸残基（β135アスパラギン酸/グリシン）だけが異なり（B1 ∗ 0201対B1 ∗ 0202）、この小さな違いが機能的な結果をもたらす可能性は低い[324] 。明らかに、APCの表面に表されるA1 ∗ 0501 / B1 ∗ 0201ヘテロダイマーの数は、T細胞応答の大きさを定義する。HLA-DQ2.5のヘテロ接合体の個体は、ホモ接合体の個体よりもグルテンペプチドを提示できるヘテロダイマーの存在量がはるかに少ない（図1.16）[300]。

 

第二に、HLA-DQ2.5のそれぞれにおけるCD発生の可能性は、HLA-DQ2.2のそれぞれよりもはるかに高い。この違いは、免疫原性ペプチドの結合エピトープの位置position 3のプロリン（図1.17 [325]）がHLA-DQ2.2（A1 ∗ 0201 / B1 ∗ 0202）への結合に悪影響を与えるという事実によって説明される。その結果、HLA-DQ2.5は、HLA-DQ2.2よりもはるかに幅広いグルテンペプチドのレパートリーを提示できるのに優れている。第三に、CDは主にHLA-DQ2.5に関連し、HLA-DQ8にはあまり関連しない。 HLA-DQ2.5制限ペプチド（表1.5）とは対照的に、HLA-DQ8制限ペプチドはプロリンが豊富な領域に由来しない可能性があるため、おそらく胃腸管での分解を受けやすくなる。第四に、ほとんどのCD患者がオート麦に耐性があるという事実は、グルテンの提示レベルが重要なパラメーターであるというさらなる証拠を提供する。アベニン（オート麦タンパク質）には免疫原性エピトープが2つしか含まれていないが（表1.5）、小麦、ライ麦、大麦のグルテンタンパク質には数十のエピトープがある。要約すると、これらのデータは、CDの成りやすさの閾値の存在を示している。 HLA-DQ2.5ホモ接合体のそれぞれの場合、閾値は最も簡単に超えられるが、一方HLA-DQ2.2とHLA-DQ８のそれぞれは閾値がそれよりずっと高い。

 

6.3.1.3 Cellular Response（細胞応答）

 

腸細胞層を通過して固有層に到達したグルテンペプチドは、細胞外TG2の基質として好ましい。脱アミド化とアミド交換が起こる場所と時期は依然として問題である。アミド分解とアミド交換の比率は、約1：3と推定されている[160]。細胞外マトリックスに放出されたTG2は通常、短時間だけ触媒活性を維持し、すぐに酸化により沈黙する。この不活性化に関与するCys 230、Cys 370、およびCys 371は、Cys 370からCys 230または隣接するCys 371のいずれかに結合したジスルフィド結合を形成する[326]。ただし、高いCa^{2 +}レベルと進行中の免疫応答によって引き起こされる還元環境の増加により、TG2を不活性化から保護できる。細胞外TG2の存在に関する別の説明がTjonのグループによって提案された[38]。 HLA-DQ分子に対するネイティブ（脱アミド化されていない）グルテンペプチドの親和性が弱い場合でも、CD4 + T細胞への提示によりIFN-γが生成される。次の軽度の炎症は、TG2放出による組織損傷を引き起こし、脱アミド化による適応免疫応答を強化する可能性がある。

 

固有層に現れる天然および脱アミド化グルテンペプチドは、APC(抗原提示細胞)、主に樹状細胞だけでなくマクロファージおよびB細胞（抗体生成細胞）の表面に発現するHLA-DQ2 / 8分子に選択的に結合する（図1.10のステップ4）。これは、これらの遺伝的に決定されたHLA分子と疾患の発症との間に確立された関連性の説明を提供する。 DQ2およびDQ8ヘテロダイマーは、それらのペプチド溝とグルテンペプチドとを結合して後、粘膜固有層のT細胞に提示する。可変長のグルテンペプチドは、通常9アミノ酸残基（position 1〜position 9）で結合され、1つ以上の追加の残基が隣接し、好ましくは左回りのpoly-P ro IIヘリックス立体配座がある[327]。 HLA-DQ2の溝の主要なアンカーポイントは、位置p1、p4、p6、p7、およびp9にある（図1.17）。前述のように、免疫原性脱アミド化グリアジンペプチドα57-68/ E65（QLQPFPQPELPY）と複合体を形成したHLA-DQ2.5の結晶構造は、2つの分子間に複雑な水素結合ネットワークの存在を示した（図1.15）[320]。ペプチドの脱アミド型（E65）は、非脱アミド型（Q65）と比較して25倍高い親和性を示した。明らかに、HLA-DQ2.5のβ71のリジン残基はposition 4とposition 6/position 7のアンカーポジションの間のユニークなポジテブ静電気的区域を作り，エピトープでネガテブにチャージするグルタミン酸残基との結合はここの位置で起こる事は好ましい。

 

グルテンペプチド（天然、脱アミド化、TG2架橋）をAPC(Antigen- presenting cell)表面のHLA-DQ2 / 8分子のペプチド溝に結合した後、化合物はCD4 ⁺ T細胞に提示される（図1.10のステップ4）。 T細胞は、B細胞の形質細胞および記憶細胞への成熟、細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化など、免疫プロセスにおいて他の白血球を支援する。それらの応答は、病原性であるため、つまり組織損傷を誘発するために特定のしきい値を達成する必要がある。 TCR（T-cell receptor、T細胞受容体）は、T細胞に膜結合したヘテロダイマータンパク質であり、HLA-DQ2 / 8によって提示される抗原を認識する役割を果たす。それらは主にジスルフィド結合したα鎖とβ鎖で構成されているが、少数はγ鎖とδ鎖で構成されている。 TCRは、α鎖とβ鎖によって形成される抗原結合部位の構造によって決定される独自の抗原特異性を持ち、ペプチド/ MHC（(Major histocompatibility complex)複合体；主要組織適合性複合体）との接触によって活性化される。腸組織中で抗原に結合したAPC（Antigen-presenting cell）は、腸間膜リンパ節に移動することができるが、そこでは抗原提示とナイーブ（うぶな）CD4 ⁺ T細胞のプライミング（免疫記憶）が起こる [123]。活性化後、グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は、全身循環の短い通過後に固有層に戻る。組織では、プライムCD4 ⁺ T細胞は、グルテンを消費する患者のグルテンペプチドを提示する局所常駐APCによって再活性化されるか、グルテンフリー食事をしている患者のメモリーT細胞として休眠状態のままである。

 

1993年、Lundinと同僚は、CD患者の小腸生検におけるグルテン感受性T細胞の存在を最初に記述した[328]。それ以来、多くの研究により、このようなT細胞はグルテンに由来する多数のペプチドに特異的であり、患者ごとに異なる可能性のあることが確立された。グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は、in vitro試験後の対照群からではなく、患者の生検標本から容易に分離できる [329]。ただし、これらの抗原特異的細胞を直接視覚化および定量化するための特定の技術が不足しているため、固有層におけるグルテン感受性T細胞の正確な有病率を推定することは困難である。 CD患者の腸生検から直接CD4 ⁺ T細胞をクローニングすることにより、Boddと同僚は、CD4 ⁺ T細胞の0.5〜1.8％がグルテン感受性であることを発見した[330]。これらの細胞の約半分は、免疫原性DQ2.5-グリア-α1aまたはDQ2.5-グリア-α2エピトープのいずれかに特異的だった。フローサイトメトリーで評価すると、10人の未治療CD患者すべてにテトラマー陽性T細胞が存在し、グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は0.1〜1.2％の頻度と調査された。グルテン感受性T細胞は、ほとんどの治療を受けたCD患者でも検出可能であった（7/10）。グルテン感受性T細胞の頻度は、腸粘膜の組織学的損傷の程度とIgA TGAレベルとも相関していた。粘膜固有層におけるT細胞の浸潤は、α/βTCR（T-cell receptor）を持つCD4 ⁺メモリーT細胞（CD45R0 +）によって支配されている。 T細胞認識に必要なペプチドの最小長は9アミノ酸残基である[324]。33-merペプチドなどの複数のHLA-DQ2 / 8結合エピトープを含む大きなペプチドは、単一の結合配列のみを含む小さなペプチドよりも大きなT細胞刺激活性を有す[273]。 TG2によるグルタミンの脱アミド化は、特に子供のCDの初期にT細胞活性化の絶対的な要件ではない[331]。ただし、TG2による脱アミド化は、DQ2 / 8-グルテンペプチド複合体のレベルを高めるだけでなく、in vivoでのグルテン反応性TCRレパートリーの選択にも直接関与する[123]。

グルテン感受性T細胞を活性化するグルテンペプチドの免疫原性エピトープの共通の特徴は、複数のグルタミンおよびプロリン残基の存在である（表1.5）。しかし、修飾ペプチドを用いた数多くの研究により、他のアミノ酸残基も刺激効果に強い影響を与えることが明らかになっている。十分に実証された例は、α-グリアジンの配列領域56〜75であり、65位のグルタミンの脱アミド化後にHLA-DQ2によって提示される最も頻繁に研究されているエピトープの1つである（Qグルタミン65→Eグルタミン酸65）。配列PQPELPYPQPQLPY（α62-75 / E65）は、E65を除く各位置でアラニンによって修飾され、T細胞刺激のテストがされた[332]。結果は、Qグルタミン72、Lロイシン73、Pプロリン74、またはYチロシン75の置換は刺激指数に影響を及ぼさなかったが、他のすべての置換は活性を無効にすることを実証した（図1.18）。 これは、配列PQPELPYPQPの各残基がT細胞刺激に寄与することを示した。 著者らは、Q63、P64、L66、P69、およびP71（アンカー位置position 2、p3、p5、p8、およびp10）はすべてTCRと相互作用する可能性があり、他はDQ2結合の重要な残基であると仮定した（図1.17）。

 

HMW-GS 1Dx2で同定されたHLA-DQ8制限エピトープは、残基723〜735（QQGYYPTSPQQSG）の最小コア領域を持つことが示され（図1.19）、T細胞刺激のための脱アミド化を必要としなかった[333]。グルタミン残基Q724およびQ732は、それぞれDQ8 / TCR複合体内のアンカー位置p1およびp9を占めると予想された。 T細胞刺激に寄与する残基を特定するために、一連の置換類似体をテストした[334]。 p2でのG725、p4でのY727、p5でのP728、およびp8でのP731の置換は、T細胞認識を無効にした。 P728およびP731の重要な役割は、おそらく結合溝内のペプチドの正しい立体構造の維持を反映している。対照的に、置換はp3（Y726）、p6（T729）、およびp7（S730）で受け入れられる。 p1、Q733、またはS734でのQ724の置換はほとんど効果がなかった。アラニン（A）またはアスパラギン（N）によるp9でのQ732の置換は、T細胞刺激を大幅に減少させましたが、リジン（K）またはグルタミン酸（E）などの荷電残基によるQ732の置換は刺激を無効にした。

 

適応免疫系内では、グルテンペプチドによって活性化されたT細胞は2つの異なる反応を誘発する。炎症性Th1反応は上皮を損傷し、抗炎症Th2反応はB細胞を促進して抗体を産生する（それぞれ図1.10のステップ5と6） 。 グルテン感受性T細胞が腸上皮に細胞毒性効果を及ぼす詳細なメカニズムはまだ不明である。 固有層のCD4 ⁺ T細胞は、グルテンペプチドの認識時に活性化され、IFN-γ、IL-4、IL-21、TNF-α、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などの多くの異なるサイトカインとケモカインを産生する（ステップ5 図1.10）。

 

IFN-γの産生は、粘膜損傷の下流での開始に重要な役割を果たすと考えられている。 IFN-γは二量体化された可溶性サイトカインであり、インターフェロンのタイプIIクラスの唯一のメンバーである。モノマーは、6つのαヘリックスのコアとC末端領域の拡張された折り畳まれていない配列で構成されている。 IFN-γは、ウイルスおよび細菌感染に対する自然免疫および適応免疫に関与し、マクロファージの重要な活性化因子である。多くの自己炎症性疾患および自己免疫疾患は、異常なIFN-γの発現に関連している。 IFN-γとIFN-γの合成を媒介するIL-18は、グルテンペプチドで刺激するとグルテン感受性T細胞によって大量に産生され、上皮透過性の増加に関連している[335]。さらに、IFN-γはHLA-DQ分子のより高い発現を開始し、それによりペプチド提示が増加し、適応免疫応答の自己増幅ループにつながる[38]。 IFN-γの中和は、少なくとも器官培養で維持されたCD粘膜の生検において、グルテン誘発性の粘膜損傷を防ぐことが示されている[336]。

 

IFN-γに加えて、TNF-αおよびMMPは炎症性免疫応答における重要な因子である。 TNF-αは、さまざまな機能を持ち、細胞死（アポトーシス）を引き起こす可能性がある単球由来のサイトカインである。 TNF-αは、それぞれ233アミノ酸残基のホモ三量体複合体を形成し、水素結合により強く安定化されている。 MMPは亜鉛依存性エンドペプチダーゼであり、あらゆる種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解できるが、多くの生物活性分子を処理することもできる。 これらのタンパク質はCDで上方制御され、CD患者の小腸におけるT細胞媒介性損傷の重要なメディエーターであることが示されている[336]。

6.3.1.4   体液性応答

グルテンタンパク質およびTG2に対する血清抗体の存在は、活性CDの特異的マーカーである。 B細胞は、抗炎症性Th2応答内の液性免疫の重要な部分である（図1.10のステップ6）。それらの主な機能は、抗原に対する抗体を産生し、抗原相互作用による活性化後に記憶B細胞に発達することである。抗原に対するほとんどの反応はT細胞に依存しているため、T細胞の助けが必要である。 CDの場合、固有層の抗原提示細胞は、グルテン感受性T細胞にグルテンペプチド（ネイティブまたは脱アミド化）を提示し、それらをプライミングする。 B細胞がプライミングされたヘルパーT細胞に同じ抗原を提示すると、T細胞はサイトカインを放出し、B細胞が増殖してグルテンタンパク質およびペプチドに対するIgAおよびIgG血清抗体を産生する形質細胞に成熟するのを助ける。

B細胞に助けを提供するTG2特異的T細胞はこれまで見つかっていないため、TG2に対する抗体のグルテン依存性産生のメカニズムは完全には理解されていない。 TG2抗体の形成を説明する仮説モデルは、TG2がグルテンペプチドに架橋することができるという事実に基づいて提案されている。TG2抗体の形成は、TG2がそれ自体を架橋して「ハプテン-キャリア様」複合体として機能できるグルテンペプチドにできるという事実に基づいて提案されている（図1.20）[123,300]。このような複合体は、TG2特異的B細胞受容体に取り込まれる。細胞内分解後、グルテンペプチドはエンドソームで放出され、HLA-DQ2 / 8ヘテロダイマーのコンテキストでグルテン感受性T細胞に提示される。これらのT細胞は、B細胞に必要な助けを提供し、B細胞は形質細胞に分化し、TG2特異的自己抗体の分泌を開始する。 TG2特異的抗体を産生する形質細胞は、CD病変で視覚化でき、標識TG2抗原を使用して分離できる[337]。平均して、形質細胞の10％はTG2特異的細胞であり、ほとんどがIgAを産生する。このモデルは、患者を無グルテン食で治療すると、TGAのレベルが低下するという観察結果に適合する。グルテンの非存在下では、グルテン感受性T細胞は刺激されないため、B細胞に助けを提供できず、抗体産生が停止する[338]。さらに、TG2特異的抗体の厳密なHLA依存性の出現の臨床的観察は、このモデルを裏付けている[339]。このモデルはin vivoで正式に実証されていないが、di Niro等は TG2特異的B細胞は、TG2グルテンペプチドコンジュゲートを提供した場合に、グルテン感受性T細胞に実際にグルテンペプチドを提示できるというin vitroでの証拠を提供した[337]。 代替仮説は、粘膜樹状細胞が、胸腺での負の選択を逃れた自己反応性TG2特異的T細胞にTG2を提示する可能性があることである[308]。 これらのTG2特異的T細胞は、TGAの産生のためにTG2特異的B細胞に直接の助けを提供できる。 TG2固有のHLA-DQ2制限付きTの存在の予備的なデモンストレーションは、CD患者の末梢血からの細胞クローンは、この2番目のモデルを確認するようであり、T細胞自己抗原としてのTG2の役割を示唆している。