6.3.2   生来の反応 (先天性((自然))免疫応答)

1980年代に、CD毒性ペプチドが、総グリアジン[270,340]およびA-グリアジン[271]の酵素消化物から初めて分離された。それらは、α-グリアジンのN末端配列（α3-55、α3-24、α25-55、α1-30、α31-55）に由来し、器官培養アッセイで有意な毒性効果を示した。その後、ペプチドα31-43、α31-49、およびα44-55の毒性は、点滴試験によりin vivoで確認された[341,342]。ただし、α-グリアジンのN末端配列からの5つの重複ペプチド（1-19、11-28、21-40、31-49）は、唯一HLA-DQ2ヘテロダイマーへの弱いまたは中程度の結合を示し、グリアジン感受性DQ2-制限つきT細胞はこれらのペプチドを認識しない[343]。Maiuri等はこれらのペプチドがCDの先天性反応を誘発する可能性があることを示唆した最初の人だった[344]。

先天性(自然)免疫応答の役割は、CDの病因にいくつかの方法で関与していると思われるため、現在非常に重要になっている。自然免疫は適応免疫と協力して、炎症性Th1応答を誘導し、IEL（Intraepithelial lymphocyte）の数を増やし、上皮に対する細胞溶解攻撃を促進する[345]。先天性反応は、HLA-DQ2陽性のCD患者に見られるが、HLA-DQ2陽性の非CD対照には見られない。 この特異な先天性反応は、なぜDQ2陽性の一部の人だけがCDを発症するのかを説明するかもしれない。 特定の毒性グルテンペプチドは、適応免疫系によって認識されないが、自然免疫系を刺激する。 これまで、α-グリアジン由来のペプチドのみが自然免疫応答の引き金となる因子として同定されてきた。 ライ麦、大麦、オート麦には、α型に属するタンパク質が欠けている。 したがって、これらの穀物からのペプチドが生得的（自然免疫的）な反応を開始できるかどうかは不明である。

α31-49などのペプチドが先天性（自然免疫的）応答を活性化するという事実は、これらのペプチドの受容体が存在するはずであることを意味する。 AGA（Anti-gliadin antiboy）がペプチドα31-49に結合できる場合の経細胞輸送経路が提案された[285]。 この複合体は、次にトランスフェリン受容体CD71に結合し、これは腸上皮全体で保護された獲得免疫を提供する。 Tjon et al., [38]は、ペプチドα31-49の受容体が腸上皮細胞に存在するという仮説も評価した。しかし、この受容体は、直接的にも、UV架橋またはTG2誘導のアミド交換によっても検出できなかった。結論として、腸細胞に対するグリアジンペプチドの直接的なシグナル伝達効果を実証する堅牢なデータはまだ失われており、いわゆる毒性ペプチドの作用メカニズムを明らかにするためにより多くの作業が必要である[293]。

IEL(Intracepithelial lymphocyte)の増加は、CDの主な機能の1つである。 IELは、固有層のCD4 ⁺グルテン感受性T細胞とは表現型および機能が異なる。それらは、上皮の基底外側の腸上皮細胞の間に存在するT細胞の豊富で不均一な集団を表している[299,346]。それらの主な役割は、腸上皮を損傷する可能性のある望ましくない過度の炎症反応を回避しながら、病原体の侵入と拡散を防ぐことにより免疫保護を促進することである。それらは、細胞溶解機能を発揮して、感染細胞および損傷細胞を排除し、上皮の治癒および修復に寄与する調節機能を発揮する。ただし、CDで見られるような炎症および組織破壊反応にも寄与する。 IELは、αβまたはγδTCR（TCRαβ+またはTCRγδ+）およびナチュラルキラー（NK）細胞を保持する、抗原経験のあるメモリーエフェクターT細胞サブタイプCD8 ⁺で構成される[346]。正常な腸のIEL集団は、TCRαβ+ T細胞とTCRγδ+ T細胞で構成されており、約5：1の比率である。

CDの絨毛萎縮に対するIELの寄与は、いくつかの研究によって示唆されており、次の事実に基づいている[299]：
1. CD8 ⁺ IELは、アクティブCDのIFN-γの主な生産者である。
2. CD8 ⁺ IELは細胞溶解性タンパク質（パーフォリン、グランザイム、FasL）に富んでいる。
3.後者のタンパク質の発現は、上皮アポトーシスの増加と関連している。

上皮浸潤はグルテン摂取と高度に相関しており、したがってCDの最も敏感な組織病理学的マーカーであると考えられている[346]。腸細胞100個あたり20〜25個のIELのカウントが境界線であると推定される正常生検とCD損傷生検の間、30を超える値は「病理学的上皮内リンパ球増加症」を表す。特に絨毛先端における絨毛に沿ったIELの分布も、CDの診断のための敏感な形態学的特徴を表している。 TCRαβ⁺ IELの数は、グルテンフリー食を開始すると正常に戻る。対照的に、TCRγδ⁺ IELの数はその後何年も高いままであり、TCRγδ⁺ IELではなくTCRαβ⁺が絨毛萎縮に関連している可能性があることを示している。 CD患者の上皮においてTCRγδ⁺ IELが果たす正確な役割は、まだ議論されている。 Baghatと同僚は、TCRαβ⁺ IELが腸細胞に有害な影響を与え、TCRγδ⁺ IELによって拮抗されることを提案した[347]。この規制機能は、アクティブCDでは圧倒される可能性がある。 CD患者のTCRγδ⁺ IELサブセットが抗原駆動型であるかどうか、および認識される抗原の正確な性質はまだ解明されてない。ほとんどのIELは、さまざまなNK細胞受容体を発現する。健康な小腸では、IELは主に抑制性CD94 / NKG2A受容体を発現します。対照的に、CDのIELはCD94 / NKG2CやNKG2Dのような高レベルの活性化受容体を発現する[346]。

サイトカインIL-15は、グルテン誘発性免疫応答のこの部分の中心的役割を果たすと考えられている。炎症性および抗アポトーシスサイトカインであるIL-15は、CD患者の腸で過剰に産生される。小腸生検の器官培養の使用は、このサイトカインの中和が実際にCD病因カスケードを妨げるかもしれないことを明らかにした[344]。 IL-15は、分子量が約14,000の糖タンパク質であり、多数の細胞タイプと組織で発現し、自然免疫と適応免疫の両方で重要な役割を果たす。特に、T細胞とNK細胞の刺激と増殖を調節する。アクティブCDでは、IL-15は上皮細胞と固有層の両方で産生されますが、適応免疫応答に関与するT細胞とB細胞では産生されない。α31-43や伸長型α31-49などのグルテンペプチドは、腸細胞[348]、マクロファージ[349]、および樹状細胞[350,351]の活性化によりIL-15分泌を直接誘導する。これらのペプチドは、HLA-DQ制限T細胞を刺激せず、CD患者でのみIL-15産生を活性化しますが、健常対照では活性化しない。 IL-15は、Tregs(制御性 T細胞 )の有益な抑制能力を損ない、IL-15の存在下でretinoic acid(ビタミンAの代謝物)は思いがけず腸粘膜でグリアジンに炎症性免疫（IL-12とIL-23）の調整特性を引き起こす。この理由でビタミンAを CDに補充する事が不承認される。

IL-15は、IELの増殖と生存を強力に誘導することが知られている。 IL-15の大部分は腸細胞の表面に結合したままで、IEL（Intraepithelial lymphocyte）に提示される。 IL-15はIELを刺激してNKG2D受容体を発現させ、上皮細胞を発現させてNKG2Dの上皮リガンドであるMHCクラスI鎖関連分子A（MICA）を発現させる[353,354]。 NKG2D受容体がMICAに関与すると、IELは上皮細胞を殺し、組織破壊に寄与する。したがって、腸上皮細胞におけるIL-15の発現は、細胞アポトーシス、絨毛萎縮、および腸炎症を伴う[355]。損傷した上皮が選択的バリアとして適切に機能しないため、免疫原性グルテンペプチドが組織にアクセスできるようになることは容易に想像できる。これらの発見は、IL-15の発現がそれ自体で絨毛性萎縮および陰窩過形成を誘発するのに十分であるかどうかという問題を提起する[120]。

穀物に存在するATI(Amylase trypsin inhibitor)は、自然免疫系のコアクチベーターであることが示唆されている[162]。小麦の両方とも害虫抵抗性分子であるATI CM3およびO.19は、単球、マクロファージ、および樹状細胞における自然免疫応答の強力な活性化因子として同定された。これらの細胞は高度に保存された膜結合分子のクラスであるToll様受容体（TLR）を発現する。これは、微生物の認識に主要な役割を持ち、したがって防御の第一線で作用する。 ATIはTLR4-MD2-CD14複合体に関与し、成熟マーカーのアップレギュレーションをもたらし、CDおよび非CD患者の細胞およびCD患者の生検で炎症性サイトカインの放出を誘発する。 TLR4(TOLL様受容体の１つ)またはTLR4シグナル伝達が欠損したマウスは、ATIを経口投与すると、腸および全身の免疫反応から保護される。これらの調査結果は、穀物のATIをCDの新規寄与者として定義している。さらに、ATIは、他の腸管および非腸管免疫障害における炎症および免疫反応を促進する可能性がある。

6.4  おわりに

さまざまな免疫学的メカニズムの理解の向上により、CD病因の現実的なスキームの作成が可能になった[356]。 CDの媒介における重要な環境要因は、小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦のグルテンタンパク質である。これらのタンパク質の不完全な胃腸分解により、小腸内腔にCD活性（免疫原性、毒性）グルテンペプチドが出現する。グルタミンとプロリンが豊富なこれらのペプチドは、2つのシグナル免疫応答を誘導し、最初のシグナルは自然免疫によって生成され、2番目のシグナルは適応免疫によって生成される[357]。毒性ペプチドは、IL-15発現の増加、IEL増殖、上皮細胞の炎症、腸透過性の増加を特徴とする先天性免疫応答を引き起こす。適応免疫応答では、免疫原性ペプチドは、透過性の増加とタイトジャンクションの開放により上皮バリアを通過する。粘膜固有層に到達した後、TG2によって脱アミド化または架橋される。これらの修飾ペプチドのAPC（Antigen-presenting cell）上のHLA-DQ2 / 8への結合およびグルテン感受性T細胞への提示は、炎症性Th1応答を活性化する。この応答は、IFN-γやTNF-αなどのさまざまなサイトカイン、および上皮細胞の損傷に寄与する他の免疫学的分子の産生によって特徴付けられる。 自然免疫応答と適応免疫応答の両方が、上皮のアポトーシスと粘膜破壊を引き起こし、CDの腸の炎症の発生に寄与する。 さらに、刺激されたT細胞はB細胞によって抗炎症性Th2応答を活性化する。グルテンに対する抗体およびTG2に対する自己抗体の産生を開始する細胞、適応応答の誘導における遺伝学とグルテンの相互作用は現在よく理解されていないが、先天的応答とIL-15合成の誘導における遺伝学と環境因子、特にグルテンペプチドのそれぞれの寄与を明らかにするためにさらなる研究が必要である[346]。 適応免疫と自然免疫間のクロストーク(漏話)をどのように調整するかは、CDおよびグルテン感受性のさまざまな段階をよりよく理解し、予防戦略を設計し、新しい治療アプローチを開発するために取り組む必要がある顕著な問題である[299]。 CDの自然免疫と適応免疫の正確なメカニズムを解明するために、さらなる研究が期待されるかもしれない。

6.3.1.2  HLA-DQヘテロダイマー

HLA-DQ2および-DQ8対立遺伝子は、CDの原因遺伝子である。 DQ2およびDQ8ヘテロダイマーは、APC（Antigen-presenting cell,成熟樹状細胞、マクロファージ、B細胞）の細胞表面に発現するHLAクラスII分子である。対立遺伝子A1 ∗ 0501、0505、0201、03に対応するα鎖と、対立遺伝子B1 ∗ 0201、0202、0301、0302に対応するβ鎖の完全なアミノ酸配列（シグナル伝達ペプチドなし）は、図1.14である。見てわかるように、α鎖とβ鎖のそれぞれの中の異なるタンパク質は、高度の配列相同性を示している。 DQ2 A1 ∗ 0501および0505のα鎖は、シグナル伝達ペプチドの1つのアミノ酸残基を除いて同一である。

結合したα鎖とβ鎖は、「ペプチド溝」で免疫原性グルテンペプチドに結合し、固有層のT細胞に提示する。免疫原性脱アミド化グリアジンペプチドα57-68/ E65（QLQPFPQPELPY）との複合体におけるHLA-DQ2.5の結晶学により、DQ2.5分子のペプチドグルーブ内の結合機能に関する洞察が得られた（A1 ∗ 0501 / B1 ∗ 0201） 。ヘテロダイマーのN末端ドメインが結合して溝を形成する：α鎖からの5ターンのαヘリックスは、溝の側壁を形成するβ鎖からのより長いがねじれたαヘリックスと平行に走る（図1.15）[320]。ペプチドの11残基（L（ロイシン）58〜Y（チロシン）65）が実験電子密度マップではっきりと見えた。ペプチドの主鎖原子と DQ2.5の間に13の水素結合がある。DQ2.5およびペプチド側鎖アミドとDQ2.5間の4つの水素結合ある。後者は、このペプチドの9つのコア残基のうち4つが、アミド水素結合に関与できないプロリン残基（P60、P62、P64、P67）であるため、注目に値する。各主鎖の水素結合相互作用の相対的寄与は、一連のN-メチル化ペプチド類似体を調製することにより研究された[321]。結果は、フェニルアラニンF61およびグルタミンQ63の水素結合が結合に最も重要であるのに対し、グルタミン酸E65およびチロシンY68の水素結合は、全体的な結合親和性への寄与が小さいことを示した。

HLA-DQ2.5と-DQ2.2のペプチド結合特異性は類似しているが、DQ2.2にはp3に追加の結合ポケットがあり、セリン、スレオニン、アスパラギン酸が優先され、プロリンはこの位置で不利になっているようである[322]。さらに、DQ2.2と比較してDQ2.5のはるかに高い病気危険性は、DQ2.5 分子が免疫原性ペプチドにDQ2.2（数時間）よりずっと長い（数日間）結合であると言う事により示される [36]。DQ2.2のフェニルアラニンの位置α22でのDQ2.5のチロシンによる置換（図1.14）により、DQ2.5分子のペプチドカーゴをより長時間保持する能力が明らかに向上する。 HLA-DQ2と同様に、HLA-DQ8のペプチド結合溝は、負に帯電した残基とのペプチドの結合を促進する。機能的結合研究により、グルタミン酸のアンカー( つなぎ止め )位置position 1とposition 9、疎水性残基のposition 4が示唆された（表1.5）。グルテンペプチドQQYPSGEGSFQPSQENPQと複合体を形成したHLA-DQ8の結晶構造により、結合アンカーサイトposition 1およびposition 9で負に帯電した残基が優先されることが確認された。 1つのグルタミン酸残基のみを必要とするDQ2とは対照的に、DQ8への結合には2つのグルタミン酸残基が必要である。この制約は、DQ2陽性患者と比較して、DQ8陽性患者で活性のあるグルテンペプチドの数が少ないことを説明できる。

DQ8ヘテロダイマー（A1 ∗ 03 / B1 ∗ 0302）は、DQ2.5ヘテロダイマーと強い構造的類似性を持っている（図1.14）。それでも、バックボーン構造には2つの顕著な違いがある。まず、DQ8の位置α56に2番目のアルギニン残基（R）を挿入すると、この配列領域のαヘリックスストレッチの長さに影響する。第二に、DQ2.5のβ鎖はβ71位に正に帯電したリジン残基（L）を有し、これは免疫原性ペプチドの負に帯電したグルタミン酸の結合に重要である。 DQ8にはβ71にスレオニン（T）が含まれており、この領域には全体的に中性の静電ポテンシャルがある。この違いと一致して、エピトープα57-68/ E65がDQ8分子によって認識されることを示すデータはない[320]。

HLA-DQヘテロダイマーの組成とCDに進むリスクとの相関関係のモデルがTjonと同僚によって提示された[38]。したがって、APC（Antigen-presenting cell）によってT細胞に提示されるグルテンペプチドのレベルは、CDへの展開に重大な影響を及ぼす。まず、HLA-DQ2.5ホモ接合体の個体は、HLA-DQ2.5ヘテロ接合体の個体よりもCD発生のリスクが5倍高い。これは、HLA-DQ2.5ホモ接合体の非常に強力なT細胞応答およびIFN-γ産生と相関するが、ヘテロ接合体の個人ははるかに弱い応答を示す[35]。ホモ接合体とヘテロ接合体のヘテロダイマーは、β鎖の1アミノ酸残基（β135アスパラギン酸/グリシン）だけが異なり（B1 ∗ 0201対B1 ∗ 0202）、この小さな違いが機能的な結果をもたらす可能性は低い[324] 。明らかに、APCの表面に表されるA1 ∗ 0501 / B1 ∗ 0201ヘテロダイマーの数は、T細胞応答の大きさを定義する。HLA-DQ2.5のヘテロ接合体の個体は、ホモ接合体の個体よりもグルテンペプチドを提示できるヘテロダイマーの存在量がはるかに少ない（図1.16）[300]。

第二に、HLA-DQ2.5のそれぞれにおけるCD発生の可能性は、HLA-DQ2.2のそれぞれよりもはるかに高い。この違いは、免疫原性ペプチドの結合エピトープの位置position 3のプロリン（図1.17 [325]）がHLA-DQ2.2（A1 ∗ 0201 / B1 ∗ 0202）への結合に悪影響を与えるという事実によって説明される。その結果、HLA-DQ2.5は、HLA-DQ2.2よりもはるかに幅広いグルテンペプチドのレパートリーを提示できるのに優れている。第三に、CDは主にHLA-DQ2.5に関連し、HLA-DQ8にはあまり関連しない。 HLA-DQ2.5制限ペプチド（表1.5）とは対照的に、HLA-DQ8制限ペプチドはプロリンが豊富な領域に由来しない可能性があるため、おそらく胃腸管での分解を受けやすくなる。第四に、ほとんどのCD患者がオート麦に耐性があるという事実は、グルテンの提示レベルが重要なパラメーターであるというさらなる証拠を提供する。アベニン（オート麦タンパク質）には免疫原性エピトープが2つしか含まれていないが（表1.5）、小麦、ライ麦、大麦のグルテンタンパク質には数十のエピトープがある。要約すると、これらのデータは、CDの成りやすさの閾値の存在を示している。 HLA-DQ2.5ホモ接合体のそれぞれの場合、閾値は最も簡単に超えられるが、一方HLA-DQ2.2とHLA-DQ８のそれぞれは閾値がそれよりずっと高い。

6.3.1.3 Cellular Response（細胞応答）

腸細胞層を通過して固有層に到達したグルテンペプチドは、細胞外TG2の基質として好ましい。脱アミド化とアミド交換が起こる場所と時期は依然として問題である。アミド分解とアミド交換の比率は、約1：3と推定されている[160]。細胞外マトリックスに放出されたTG2は通常、短時間だけ触媒活性を維持し、すぐに酸化により沈黙する。この不活性化に関与するCys 230、Cys 370、およびCys 371は、Cys 370からCys 230または隣接するCys 371のいずれかに結合したジスルフィド結合を形成する[326]。ただし、高いCa^{2 +}レベルと進行中の免疫応答によって引き起こされる還元環境の増加により、TG2を不活性化から保護できる。細胞外TG2の存在に関する別の説明がTjonのグループによって提案された[38]。 HLA-DQ分子に対するネイティブ（脱アミド化されていない）グルテンペプチドの親和性が弱い場合でも、CD4 + T細胞への提示によりIFN-γが生成される。次の軽度の炎症は、TG2放出による組織損傷を引き起こし、脱アミド化による適応免疫応答を強化する可能性がある。

固有層に現れる天然および脱アミド化グルテンペプチドは、APC(抗原提示細胞)、主に樹状細胞だけでなくマクロファージおよびB細胞（抗体生成細胞）の表面に発現するHLA-DQ2 / 8分子に選択的に結合する（図1.10のステップ4）。これは、これらの遺伝的に決定されたHLA分子と疾患の発症との間に確立された関連性の説明を提供する。 DQ2およびDQ8ヘテロダイマーは、それらのペプチド溝とグルテンペプチドとを結合して後、粘膜固有層のT細胞に提示する。可変長のグルテンペプチドは、通常9アミノ酸残基（position 1〜position 9）で結合され、1つ以上の追加の残基が隣接し、好ましくは左回りのpoly-P ro IIヘリックス立体配座がある[327]。 HLA-DQ2の溝の主要なアンカーポイントは、位置p1、p4、p6、p7、およびp9にある（図1.17）。前述のように、免疫原性脱アミド化グリアジンペプチドα57-68/ E65（QLQPFPQPELPY）と複合体を形成したHLA-DQ2.5の結晶構造は、2つの分子間に複雑な水素結合ネットワークの存在を示した（図1.15）[320]。ペプチドの脱アミド型（E65）は、非脱アミド型（Q65）と比較して25倍高い親和性を示した。明らかに、HLA-DQ2.5のβ71のリジン残基はposition 4とposition 6/position 7のアンカーポジションの間のユニークなポジテブ静電気的区域を作り，エピトープでネガテブにチャージするグルタミン酸残基との結合はここの位置で起こる事は好ましい。

グルテンペプチド（天然、脱アミド化、TG2架橋）をAPC(Antigen- presenting cell)表面のHLA-DQ2 / 8分子のペプチド溝に結合した後、化合物はCD4 ⁺ T細胞に提示される（図1.10のステップ4）。 T細胞は、B細胞の形質細胞および記憶細胞への成熟、細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化など、免疫プロセスにおいて他の白血球を支援する。それらの応答は、病原性であるため、つまり組織損傷を誘発するために特定のしきい値を達成する必要がある。 TCR（T-cell receptor、T細胞受容体）は、T細胞に膜結合したヘテロダイマータンパク質であり、HLA-DQ2 / 8によって提示される抗原を認識する役割を果たす。それらは主にジスルフィド結合したα鎖とβ鎖で構成されているが、少数はγ鎖とδ鎖で構成されている。 TCRは、α鎖とβ鎖によって形成される抗原結合部位の構造によって決定される独自の抗原特異性を持ち、ペプチド/ MHC（(Major histocompatibility complex)複合体；主要組織適合性複合体）との接触によって活性化される。腸組織中で抗原に結合したAPC（Antigen-presenting cell）は、腸間膜リンパ節に移動することができるが、そこでは抗原提示とナイーブ（うぶな）CD4 ⁺ T細胞のプライミング（免疫記憶）が起こる [123]。活性化後、グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は、全身循環の短い通過後に固有層に戻る。組織では、プライムCD4 ⁺ T細胞は、グルテンを消費する患者のグルテンペプチドを提示する局所常駐APCによって再活性化されるか、グルテンフリー食事をしている患者のメモリーT細胞として休眠状態のままである。

1993年、Lundinと同僚は、CD患者の小腸生検におけるグルテン感受性T細胞の存在を最初に記述した[328]。それ以来、多くの研究により、このようなT細胞はグルテンに由来する多数のペプチドに特異的であり、患者ごとに異なる可能性のあることが確立された。グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は、in vitro試験後の対照群からではなく、患者の生検標本から容易に分離できる [329]。ただし、これらの抗原特異的細胞を直接視覚化および定量化するための特定の技術が不足しているため、固有層におけるグルテン感受性T細胞の正確な有病率を推定することは困難である。 CD患者の腸生検から直接CD4 ⁺ T細胞をクローニングすることにより、Boddと同僚は、CD4 ⁺ T細胞の0.5〜1.8％がグルテン感受性であることを発見した[330]。これらの細胞の約半分は、免疫原性DQ2.5-グリア-α1aまたはDQ2.5-グリア-α2エピトープのいずれかに特異的だった。フローサイトメトリーで評価すると、10人の未治療CD患者すべてにテトラマー陽性T細胞が存在し、グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は0.1〜1.2％の頻度と調査された。グルテン感受性T細胞は、ほとんどの治療を受けたCD患者でも検出可能であった（7/10）。グルテン感受性T細胞の頻度は、腸粘膜の組織学的損傷の程度とIgA TGAレベルとも相関していた。粘膜固有層におけるT細胞の浸潤は、α/βTCR（T-cell receptor）を持つCD4 ⁺メモリーT細胞（CD45R0 +）によって支配されている。 T細胞認識に必要なペプチドの最小長は9アミノ酸残基である[324]。33-merペプチドなどの複数のHLA-DQ2 / 8結合エピトープを含む大きなペプチドは、単一の結合配列のみを含む小さなペプチドよりも大きなT細胞刺激活性を有す[273]。 TG2によるグルタミンの脱アミド化は、特に子供のCDの初期にT細胞活性化の絶対的な要件ではない[331]。ただし、TG2による脱アミド化は、DQ2 / 8-グルテンペプチド複合体のレベルを高めるだけでなく、in vivoでのグルテン反応性TCRレパートリーの選択にも直接関与する[123]。

グルテン感受性T細胞を活性化するグルテンペプチドの免疫原性エピトープの共通の特徴は、複数のグルタミンおよびプロリン残基の存在である（表1.5）。しかし、修飾ペプチドを用いた数多くの研究により、他のアミノ酸残基も刺激効果に強い影響を与えることが明らかになっている。十分に実証された例は、α-グリアジンの配列領域56〜75であり、65位のグルタミンの脱アミド化後にHLA-DQ2によって提示される最も頻繁に研究されているエピトープの1つである（Qグルタミン65→Eグルタミン酸65）。配列PQPELPYPQPQLPY（α62-75 / E65）は、E65を除く各位置でアラニンによって修飾され、T細胞刺激のテストがされた[332]。結果は、Qグルタミン72、Lロイシン73、Pプロリン74、またはYチロシン75の置換は刺激指数に影響を及ぼさなかったが、他のすべての置換は活性を無効にすることを実証した（図1.18）。 これは、配列PQPELPYPQPの各残基がT細胞刺激に寄与することを示した。 著者らは、Q63、P64、L66、P69、およびP71（アンカー位置position 2、p3、p5、p8、およびp10）はすべてTCRと相互作用する可能性があり、他はDQ2結合の重要な残基であると仮定した（図1.17）。

HMW-GS 1Dx2で同定されたHLA-DQ8制限エピトープは、残基723〜735（QQGYYPTSPQQSG）の最小コア領域を持つことが示され（図1.19）、T細胞刺激のための脱アミド化を必要としなかった[333]。グルタミン残基Q724およびQ732は、それぞれDQ8 / TCR複合体内のアンカー位置p1およびp9を占めると予想された。 T細胞刺激に寄与する残基を特定するために、一連の置換類似体をテストした[334]。 p2でのG725、p4でのY727、p5でのP728、およびp8でのP731の置換は、T細胞認識を無効にした。 P728およびP731の重要な役割は、おそらく結合溝内のペプチドの正しい立体構造の維持を反映している。対照的に、置換はp3（Y726）、p6（T729）、およびp7（S730）で受け入れられる。 p1、Q733、またはS734でのQ724の置換はほとんど効果がなかった。アラニン（A）またはアスパラギン（N）によるp9でのQ732の置換は、T細胞刺激を大幅に減少させましたが、リジン（K）またはグルタミン酸（E）などの荷電残基によるQ732の置換は刺激を無効にした。

適応免疫系内では、グルテンペプチドによって活性化されたT細胞は2つの異なる反応を誘発する。炎症性Th1反応は上皮を損傷し、抗炎症Th2反応はB細胞を促進して抗体を産生する（それぞれ図1.10のステップ5と6） 。 グルテン感受性T細胞が腸上皮に細胞毒性効果を及ぼす詳細なメカニズムはまだ不明である。 固有層のCD4 ⁺ T細胞は、グルテンペプチドの認識時に活性化され、IFN-γ、IL-4、IL-21、TNF-α、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などの多くの異なるサイトカインとケモカインを産生する（ステップ5 図1.10）。

IFN-γの産生は、粘膜損傷の下流での開始に重要な役割を果たすと考えられている。 IFN-γは二量体化された可溶性サイトカインであり、インターフェロンのタイプIIクラスの唯一のメンバーである。モノマーは、6つのαヘリックスのコアとC末端領域の拡張された折り畳まれていない配列で構成されている。 IFN-γは、ウイルスおよび細菌感染に対する自然免疫および適応免疫に関与し、マクロファージの重要な活性化因子である。多くの自己炎症性疾患および自己免疫疾患は、異常なIFN-γの発現に関連している。 IFN-γとIFN-γの合成を媒介するIL-18は、グルテンペプチドで刺激するとグルテン感受性T細胞によって大量に産生され、上皮透過性の増加に関連している[335]。さらに、IFN-γはHLA-DQ分子のより高い発現を開始し、それによりペプチド提示が増加し、適応免疫応答の自己増幅ループにつながる[38]。 IFN-γの中和は、少なくとも器官培養で維持されたCD粘膜の生検において、グルテン誘発性の粘膜損傷を防ぐことが示されている[336]。

IFN-γに加えて、TNF-αおよびMMPは炎症性免疫応答における重要な因子である。 TNF-αは、さまざまな機能を持ち、細胞死（アポトーシス）を引き起こす可能性がある単球由来のサイトカインである。 TNF-αは、それぞれ233アミノ酸残基のホモ三量体複合体を形成し、水素結合により強く安定化されている。 MMPは亜鉛依存性エンドペプチダーゼであり、あらゆる種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解できるが、多くの生物活性分子を処理することもできる。 これらのタンパク質はCDで上方制御され、CD患者の小腸におけるT細胞媒介性損傷の重要なメディエーターであることが示されている[336]。

6.3.1.4   体液性応答

グルテンタンパク質およびTG2に対する血清抗体の存在は、活性CDの特異的マーカーである。 B細胞は、抗炎症性Th2応答内の液性免疫の重要な部分である（図1.10のステップ6）。それらの主な機能は、抗原に対する抗体を産生し、抗原相互作用による活性化後に記憶B細胞に発達することである。抗原に対するほとんどの反応はT細胞に依存しているため、T細胞の助けが必要である。 CDの場合、固有層の抗原提示細胞は、グルテン感受性T細胞にグルテンペプチド（ネイティブまたは脱アミド化）を提示し、それらをプライミングする。 B細胞がプライミングされたヘルパーT細胞に同じ抗原を提示すると、T細胞はサイトカインを放出し、B細胞が増殖してグルテンタンパク質およびペプチドに対するIgAおよびIgG血清抗体を産生する形質細胞に成熟するのを助ける。

B細胞に助けを提供するTG2特異的T細胞はこれまで見つかっていないため、TG2に対する抗体のグルテン依存性産生のメカニズムは完全には理解されていない。 TG2抗体の形成を説明する仮説モデルは、TG2がグルテンペプチドに架橋することができるという事実に基づいて提案されている。TG2抗体の形成は、TG2がそれ自体を架橋して「ハプテン-キャリア様」複合体として機能できるグルテンペプチドにできるという事実に基づいて提案されている（図1.20）[123,300]。このような複合体は、TG2特異的B細胞受容体に取り込まれる。細胞内分解後、グルテンペプチドはエンドソームで放出され、HLA-DQ2 / 8ヘテロダイマーのコンテキストでグルテン感受性T細胞に提示される。これらのT細胞は、B細胞に必要な助けを提供し、B細胞は形質細胞に分化し、TG2特異的自己抗体の分泌を開始する。 TG2特異的抗体を産生する形質細胞は、CD病変で視覚化でき、標識TG2抗原を使用して分離できる[337]。平均して、形質細胞の10％はTG2特異的細胞であり、ほとんどがIgAを産生する。このモデルは、患者を無グルテン食で治療すると、TGAのレベルが低下するという観察結果に適合する。グルテンの非存在下では、グルテン感受性T細胞は刺激されないため、B細胞に助けを提供できず、抗体産生が停止する[338]。さらに、TG2特異的抗体の厳密なHLA依存性の出現の臨床的観察は、このモデルを裏付けている[339]。このモデルはin vivoで正式に実証されていないが、di Niro等は TG2特異的B細胞は、TG2グルテンペプチドコンジュゲートを提供した場合に、グルテン感受性T細胞に実際にグルテンペプチドを提示できるというin vitroでの証拠を提供した[337]。 代替仮説は、粘膜樹状細胞が、胸腺での負の選択を逃れた自己反応性TG2特異的T細胞にTG2を提示する可能性があることである[308]。 これらのTG2特異的T細胞は、TGAの産生のためにTG2特異的B細胞に直接の助けを提供できる。 TG2固有のHLA-DQ2制限付きTの存在の予備的なデモンストレーションは、CD患者の末梢血からの細胞クローンは、この2番目のモデルを確認するようであり、T細胞自己抗原としてのTG2の役割を示唆している。

6.3  免疫応答
進化の過程で病原体と戦うために徐々に構築される人間の免疫システムには、先天性（自然）免疫のメカニズムと適応免疫のメカニズムの両方が関係している。高速自然免疫系は、原始的な多細胞生物の非常に早い時期に発達し、哺乳動物で副次的機能を担うために複雑さを徐々に獲得した：特異性が低く記憶がないにもかかわらず即時の障害に対する役割と、MHC(Major histocompatibility complex,主要組織適合遺伝子複合体分子)分子（299）を介した適応免疫メカニズムに対する抗原提示の２番目の役割がある。遅い適応システムは、脊椎動物でずっと後に出現し、BおよびTリンパ球に依存して、長期記憶を備えた遅延しているが非常に特異的な応答を可能にする。

腸関連リンパ組織（GALT）は、免疫系の最大でおそらく最も複雑な部分である[300]。 400m²の表面上で外来抗原の複雑な混合物と連続的に接触している。 GALTは、病原性微生物と食物化合物などの無害な抗原を区別する必要がある。したがって、特定のシグナルが炎症反応を引き起こさない限り、腸管免疫のデフォルト設定（初期設定）は耐性の生成である。腸粘膜に損傷を引き起こすCDの免疫学的メカニズムは複雑であり、多数の免疫担当細胞と免疫学的メディエーター（仲介者）が関与する反応を構成する。 CDの適応免疫応答におけるグルテンペプチドの役割は十分に確立されている。自然免疫応答に関して、いくつかの未解決の問題が存在する。特に、自然免疫と適応免疫のコラボレーションはまだ不明のままである。しかし、適応応答と生得（自然）応答の両方がグルテンを含まない食事で軽減するという事実は、相互依存の可能性を探る方法を示唆している。

6.3.1  適応応答

HLA-DQ2 / 8対立遺伝子がCDの主要な遺伝的危険因子であることが発見されてから[301]、CDの病因において適応免疫応答が中心的な役割を果たすことが説得力をもって確立された。適応免疫は、主な遺伝因子（HLA-DQ2 / 8）と主な環境因子（グルテン）の間に議論の余地のないリンクを提供する。過去数十年間の数多くの研究が、グルテンペプチドに対する適応免疫応答の理解における重要な進歩に貢献した。固有層（基底膜）の免疫カスケードの主要なプレーヤーは、細胞レベルのAPC、T細胞、およびB細胞と、分子レベルのTG2、HLA-DQ2 / 8ヘテロダイマー、T細胞受容体（TCR）、サイトカイン、およびケモカインである（図1.10）。

6.3.1.1  トランスグルタミナーゼ

腸組織に存在するTG（Transglutaminase）は、CDの適応免疫応答に決定的に寄与する。 TG（タンパク質グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼ、EC 2.3.2.13）は、グルタミン側鎖（アシルドナー）から一級アミン（アシルアクセプター）へのアシル転移を触媒する酵素である。 TGの最も重要な生理学的機能は、グルタミン残基を含むタンパク質からリジン残基を含む別のタンパク質への共有結合的かつ不可逆的なアミド交換であり、ε-（γ-グルタミル）-リジンイソペプチド結合の形成をもたらす（図1.12（A ））[302]。多くの場合、機械的チャレンジとタンパク質分解に対して非常に耐性のある架橋生成物は、皮膚、髪、表皮の角質化、創傷治癒など、そのような特性が重要な多くの組織に蓄積する。さらに、TGは低分子量第一級アミンのタンパク質への取り込みにより、アミド交換反応を触媒する。特定の条件下で、特にリジンのε-アミノ基または他の一級アミノ基が利用できない場合、または比較的低いpH値では、グルタミンは水との反応によりグルタミン酸に脱アミド化される（図1.12（B））。

TGは、1959年にMycekと同僚によって、インスリンへのアミンの取り込みを触媒するモルモット肝臓の酵素として初めて報告された[303]。その後の多数の調査により、TGはすべての真核生物に遍在し、哺乳類では8つの異なるTG（TG1-7、第VIII因子）が検出されていることが示された。これらの異なるTGはすべて、触媒部位で共通のアミノ酸配列を共有し、類似した遺伝子構造を持っているが、別々の遺伝子によってコードされ、異なる基質特異性と機能を示す。それらの酵素活性はCa^{2 +}依存性であり、グアノシン二リン酸および三リン酸（GDP / GTP）を含む他の因子も哺乳類TGのいくつかの活性に影響を与える。活性化すると、酵素は劇的なコンフォメーション変化を起こす。この変化では、C末端残基が1.2pmほど置換される[304]。

一般的に「組織トランスグルタミナーゼ」と呼ばれるTG2は、おそらくTGファミリーの最も遍在的かつ多機能なメンバーである[305]。 Wolfと同僚が開発した高感度のELISAにより、TG2の検出と定量が可能になった[306]。 TG2は、アシルトランスフェラーゼとして作用するほか、Gタンパク質、アダプタータンパク質、細胞表面接着メディエーター、ジスルフィドイソメラーゼ、およびセリン/スレオニンキナーゼとしても作用する[307]。 TG2活性の調節不全は、慢性変性疾患、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、または感染症などのいくつかの病的状態に関連している[308]。 CD患者の抗体の標的とする主要な自己抗原として同定されたため[113]、TG2はCDの病因と診断の調査において重要な役割を果たしてきた。

TG2は、687アミノ酸残基の単量体タンパク質で、分子量は約76,000である。 N末端βサンドイッチドメイン（残基1〜139）、α/β触媒コアドメイン（残基140〜460）、および2つのC末端βバレルドメイン（残基461〜それぞれ538および539-687）（図1.13）[305]。システイン（C）277、ヒスチジン（H）335、およびアスパラギン酸（D）358はアシル転移の活性部位を形成し、残基430-453はCa2 +結合部位を形成する。アミド交換またはアミド分解の最初のステップは、タンパク質/ペプチド結合グルタミン残基によるシステイン277の活性部位のアシル化で構成され、アンモニアの遊離とTG2と対応するタンパク質/ペプチド間のチオエステル中間体の形成をもたらす。アミド交換反応では、タンパク質結合リジン残基のε-アミノ基などの求核性一級アミノ基がチオエステル中間体に結合する。脱アミド化反応では、水はグルタミン残基からグルタミン酸残基への転換につながる求核剤である。 おそらく、CDに関与するグルテンペプチドは、ヒスタミンへの一次トランスアミド化を介して脱アミド化される可能性があり、その分泌はCD患者で増加する[309]。 TG2のさらなる特性は、GTP（guanosine triphosphates）に結合して加水分解する能力である。この活性はアシル転移活性とは無関係だが、GTPの結合はアシル転移触媒部位への基質結合を阻害する。

もともと、TG2は、通常の生理学的条件下では健康な細胞によって分泌されないサイトゾルでのみ見られる細胞内タンパク質と見なされていた。細胞のストレスまたは損傷のみが、酵素の細胞外マトリックスへの漏出を引き起こす可能性がある。より最近の研究では、TG2は通常の条件下で細胞外空間に分泌され、細胞外マトリックスの安定化とリモデリングに寄与することが示されている[310]。しかし、TG2が分泌されるメカニズムは未だ謎のままであり、「TG2の活性と炎症のどちらが先か？」という疑問が未解決のままである。細胞外環境に分泌されると、高Ca ²⁺および低GTPレベルは、閉じた不活性な立体構造を触媒活性に必要な開いた活性な立体構造に変換することにより、酵素の活性化を促進する。フィブロネクチン、コラーゲン、グルテンペプチドなど、多くのタンパク質およびペプチドが架橋の潜在的な基質である。

CDにおけるTG2の可能な役割を説明した最初の研究は、Bruceのグループによって公開された[311]。 対照と比較して、未治療および治療CD患者の空腸組織でTG2活性が増加し、グルタミンに富むグリアジンペプチドがTG2の優先的基質を表すことが示された。 次の多くの調査により、架橋と脱アミド化の両方が起こることが明らかになり、脱アミド化の生理学的重要性はCDとの関連でのみ確立された。 グルタミンは一般に主要なアミノ酸残基であるため、グルテンタンパク質およびペプチドはTG2の好ましい基質（アシル供与体）である。

CDの病原性カスケード（流れ、連鎖）では、脱アミド化とアミド交換の両方が重要とみなされる（図1.10のステップ3）。 第一に、TG2はグルテンペプチドの特定のグルタミン残基をdeamidatingが可能で、親和性を高めてHLA-DQ2 / 8分子に結合する修飾エピトープを作成する（以下を参照）。第二に、TG2はグルテンペプチドを、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質やそれ自体を含む他のタンパク質に架橋することができる。そのような架橋は、固有層におけるグルテンペプチドの蓄積を促進する（「ハプテンキャリアモデル」）。さらに、グルテンペプチドとTG2の結合体は、TGA（抗体）の産生を活性化する。適応免疫応答におけるTG2の中心的な役割により、その選択的阻害はCDの代替治療アプローチと見なされている。

グルタミン残基の脱アミド化は、特にHLA-DQ8ヘテロダイマーの場合にはCD4 ⁺ T細胞の刺激が絶対必要ではないが、HLA-DQ2 / 8へのペプチド結合には強く好ましい。 TG2による脱アミド化は、選択されたグルタミン残基にのみ特異的であり、標的グルタミンに隣接するアミノ酸に依存する。グルタミンに対するプロリンおよび疎水性アミノ酸の相対的な位置が重要であることは、合成ペプチドライブラリーによって実証されている[312,313]。配列QXPおよびQXXF（Xは任意のアミノ酸を表し、Q、Pはそれぞれグルタミン、プロリンで、Fは疎水性アミノ酸を表す）はTG2の好ましい基質として同定されているが、QPおよびQXXP配列では酵素は活性ではない。したがって、TG2による脱アミド化は、グルテンペプチドへの負の電荷の非常に選択的な導入をもたらす。これらの発見に基づいて、TG2認識アルゴリズム（手順）が設計され、特権TG2認識配列のさまざまな穀物タンパク質のデータベースをスクリーニングし、多くの脱アミド化感受性エピトープが小麦グリアジンとグルテニン、ライムギセカリン、大麦ホルデイン、オート麦アベニンで同定された。 TG2によって部分的に脱アミド化されたグルテンペプチドエピトープの例を表1.5に示した。

HLA-DQ分子によって制限されるグルテン感受性T細胞エピトープの包括的な新しい命名法がSollidと同僚によって提案された[314]。例は表1.5に含まれている。命名法は、次の3つの基準に基づいている。

１.エピトープに対する反応性は、少なくともある特異的T-細胞クローンによるものであること。

2.取り込まれるHLA-制限要因は不明確に定義されている必要がある。

3.エピトープの9アミノ酸コアは、短縮型ペプチドを用いた分析および/またはエピトープのリジンスキャンを用いたHLA結合または同等のやり方のいずれかによって定義されている必要がある。

専用のウェブサイト（http://www.isscd.net/EpitopeNomenclature.htm）は、より多くのエピトープが特定されたとそのリストを更新した。ただし、F-S（LMW-GS）、Y-Y（HMW-GS）、およびF-Q（α-グリアジン）間のペプチド結合など、消化管ペプチダーゼによるこのようなエピトープの切断は、これらの基準では考慮されない。たとえば、Juhazzらは、プロテオームベースのデータセット、CD関連エピトープのコレクション、およびin silico酵素消化により、小麦「Butte-86」のグルテンタンパク質のCDエピトープの数がネイティブの549から消化物中のタンパク質を99まで[315]減少したことを示した。

アミド分解のほかに、TG2はグルテンペプチドとそれ自体の間の架橋を触媒し、HMWコンジュゲートを形成する。共焦点顕微鏡による分析により、TG2は活性CDの上皮および上皮下レベルでグリアジンと共局在し、グリアジンは十二指腸粘膜のTG2に直接結合していることが示された[316]。

TG2とQLQPFPQPQLPY配列を持つ免疫原性グルテンペプチド（α57-68）の複合体の最初の化学的特性は、2004年にFleckensteinと同僚によって報告された[317]。 2種類の共有結合したコンジュゲートが検出された。ペプチドは（1）チオエステル結合を介してTG2の活性部位システインに、（2）イソペプチド結合を介してTG2の特定のリジン残基に結合した。理論的には、TG2はイソペプチド結合形成のために33リジン残基（K）とペプチドα57-684グルタミン残基（Q）を提供する。ペプチド配列内のQ65のみがイソペプチド結合に関与していることがわかった。 TG2内のリジン残基（K）の役割は、TG2とペプチドのモル比に依存することが示された。TG2 /ペプチド比1：1の比率で関与したのはK590のみであり、K562、K590、およびK600は1:10の比率で、K444、K562、K590、K600、K649、およびK677は1:50と 1：100で関与した。イソペプチド結合形成に関与するリジン残基はランダムに分布してはいなかった。 6残基中5残基は、触媒部位から遠く離れたC末端セクションIV（図1.13）にあった。 TG2とグルテンペプチド間のイソペプチド結合の形成は強く方向付けられていると結論付けることができる。

さまざまなグリアジンに対するTG2の触媒活性は、Dieterichらによって研究された [318]。 11個のα-、6個のγ-、3個のω1,2-グリアジン、および1個のω5-グリアジンをモノダンシルカダベリン（蛍光アシルアクセプター）およびTG2とともにインキュベートし、続いて増強された蛍光強度を測定した。結果は、テストされたすべてのグリアジンがTG2の良好な基質であることを示した。対照基質であるウシ血清アルブミンおよびラクトアルブミンでは、モノダンシルカダベリンの取り込みは検出されなかった。蛍光TG2活性アッセイを使用して、グリアジンペプチドα2（56-68）の反応性グルタミン（Q）としてのQ65の絶対要件は、TG2 /ペプチドコンジュゲートの形成によって確認された。これらのコンジュゲートのCD特異的関連性は、これらの架橋ネオエピトープに対する自己抗体の産生に由来する（以下を参照）。さらにTG2は、免疫原性グルテンペプチドが、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質に結合することを触媒する。このハプテン化とグルテンペプチドの長期固定化は、CDの腸炎の永続化に重要となる可能性がある[318]。

Dorumと同僚による研究の目的は、非常に不均一なタンパク質複合体、すなわち小麦グルテン中のTG2の好ましいペプチド基質を特定することであった[319]。グルテンをペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびカルボキシペプチダーゼで消化した後、TG2および一次アミノマーカー5-ビオチンアミドフェニルアミンとともにインキュベートした。ペプチド/アミン複合体には、ストレプトアビジンDynabeadsを加え、質量分析により同定した。 TG2の好ましい基質として、合計31の異なるグルテンペプチドが見つかった。驚くべきことに、これらのペプチドの大部分は既知のグルテンT細胞エピトープを含んでいた。 33-merペプチドは、同定されたTG2基質には含まれなかった。同じ研究では、4つのα-グリアジンペプチドと1つのγ-グリアジンペプチドが、アミド交換されたグルタミン残基と脱アミド化されたグルタミン残基の両方を持っていることが示された。たとえば、ペプチドα3-24はQ16で脱アミド化され、Q21でトランスアミド化された。

CDにおけるTG2の病原性の役割の理解における大きな進歩にもかかわらず、いくつかの問題が解明されていない[308]。これらには、TG2の細胞内調節、その外在化のメカニズム、TG2によるグルテン修飾の主要部位としての腸細胞の役割、TGA（Anti-transglutaminase antibody）の触媒活性への影響、および脱アミド化および架橋酵素と自己抗原としての2つの異なる免疫関連の関係が含まれる。

6.パトホームメカニズム（病態メカニズム）

ヒトの消化管は常に高い抗原負荷にさらされているため、摂取された食物に対する耐性を維持するための多くの戦略を開発している。通常の条件下では、粘膜免疫系は、抗原特異的T細胞のアネルギーとアポトーシスの組み合わせと、調節性T細胞（Treg）によるこれらの細胞の積極的な抑制により、これらの抗原に対する厳しい耐性を発達させた[250]。これらのTregは、とりわけ抗炎症性サイトカインIL（インターロイキン）-10および形質転換成長因子βの産生を含む多くの阻害メカニズムを共有している。抑制活性に関する研究により、活性CDの粘膜ではTreg（サブセットFoxP3 +）の数が有意に増加し、組織学的重症度と相関することが示されている[251,252]。しかし、Tregの有益な抑制能力は、CD-15の腸粘膜で上方制御されるIL(インターロイキン)-15 [252]によって損なわれる可能性がある。
経口耐性の獲得は複雑なプロセスであり、完全に理解されるにはほど遠い。グルテンに対する不耐性は、潜在的に2つの異なる現象の結果である可能性がある。最初の理由は、不明な理由により、特定の個人ではグルテンに対する耐性が決して発達しなかったことである。 2つ目は、人生のある時点で以前の寛容が失われることである[253]。病原体とグルテンの間の分子模倣がグルテン耐性の喪失を引き起こす可能性があるという仮説が立てられている。例えば、ヒトアデノウイルス12型のE1bタンパク質はα-グリアジンフラグメントと配列相同性を共有することが観察され[254]、カンジダ・アルビカンス由来の菌糸壁タンパク質1はα-およびγ-グリアジンと配列相同性を共有する[ 255]。ただし、この仮説を裏付ける直接的な証拠や実験結果はない。

6.1 グルテン摂取と消化

小麦、ライ麦、大麦、オート麦製品は、世界の多くの地域で主食である。これらの国では、1日あたりのグルテン摂取量が多く、平均で15〜20 gで、一般人口の一部は50 g以上を消費している。グルテン摂取量は過去数十年間で明らかに増加し、グルテン消費量の増加はCDの有病率の増加に関連していることが示唆されている[24]。実際、小麦粒の世界的な生産量は、2000年から2002年に年間583百万トンから2010年から2012年に年間676百万トンに増加した[256]。小麦は主に人間の消費に使用されるため、小麦グルテンの消費はそれに応じて増加した可能性がある。 IgEを介したアレルゲン（抗原）とは対照的に、ほとんどのCD患者は少量のグルテンを許容する。 CD患者に有害ではない毎日のグルテン摂取の最大レベルに関する重要な質問は、ほんの数件の研究で対処された。困難は明白である：患者はグルテンの許容レベルが異なり、毒性の証拠を開発するのに必要な時間は可変であり、非常に長いかもしれない、そして挑戦されたボランティアは少なくとも2回（挑戦の前後に）生検されなければならない。それにもかかわらず、いくつかの顕著な結果が得られている[257,258]。
小児、成人の両方で、通常の1日摂取量15〜20 gと比較して1〜5 gのグルテンを投与した場合、臨床レベル、検査レベル、組織レベルでCDの有意な再発が観察された[259]。グリアジンの低めの1日4食事量を1人の患者でテストした。10mgで変化なし、100 mgでわずかに測定可能な変化、500 mgで中程度の変化、1gで小腸の形態に広範な損傷を引き起こした[260] 。別の研究では、1日あたり2.4〜4.8 mgのグルテンを摂取しても、1週間または6週間のチャレンジ後でも空腸生検に変化はなかった[261]。同様に、グリアジン4〜16 mg [262]およびグルテン20〜36 mg [263,264]は、寛解期のCD患者の腸粘膜に影響しなかった。対照的に、1日あたり100mgのグリアジンによる4週間のチャレンジは、小腸の構造の悪化を引き起こし、500mgのグリアジンでチャレンジした患者でさらに顕著になった（時折の食事の過失に対応）[265]。最も広範な研究は2007年に発表され、39人の寛解患者を対象とした前向き二重盲検プラセボ対照多施設試験が記載されている[266]。彼らは、グルテンを毎日0、10、50 mgのいずれかを含むカプセルを90日間摂取するように割り当てられた。個人差は大きいものの、3か月間の毎日のグルテン50mgで腸粘膜のはっきりしたダメージを起こすのには十分であることが実証された。

グルテン摂取に対する組織学的、血清学的、および症候性の反応の動態は、Lefflerと共同研究者らによって研究された[188]。グルテンを含まない食事をしている成人CD患者20人に、14日間、1日あたり3.0または7.5gのグルテンを投与した。十二指腸生検は、チャレンジの開始時と3日目と14日目に行われた。 TGAs（Anti-transglutaminase antibody）およびDGPAs(Deamidated gliadin peptide antibody)、ラクツロースとマンニトールの比率、および症状はより頻繁に評価された。絨毛の高さと陰窩の深さの比の有意な減少とIEL(Intraepithelial lymphocyte)の増加がベースラインから14日目まで見られた。抗体力価はベースラインから14日目までわずかに増加したが、28日目までに著しく増加した。胃腸症状は3日目までに著しく増加し、28日目までにベースラインに戻った。2つのグルテン投与量の間に差は見られなかった。

通常、食物タンパク質は、胃、膵臓、および腸の刷子縁酵素によってアミノ酸、ジペプチド、およびトリペプチドに分解される（図1.10のステップ1）。 CDの病因に関する最も初期の理論は、「ペプチダーゼ欠損仮説」に基づいていた[267]。基本的な効果は、小腸の酵素の欠乏であると考えられ、それはCD-活性ペプチドの消化に必要なものである。しかし、後に他の著者は、ペプチダーゼ活性がCD患者の粘膜でグルテンを含まない食事でも正常であることを示した[268]。そこで活動性疾患を有する患者の空腸粘膜によるグルテン消化の低下は、結果であり、疾患の原因ではないとして考えられた[269]。 今日、一般的に受け入れられていることは、グルテンタンパク質中に高頻度に存在するプロリンとヒトの胃腸管にプロリルエンドペプチダーゼ活性がないことと組み合わされて、健康な人でもこれらのタンパク質の消化が抵抗されるため、長鎖ペプチドは腸粘膜に到達するのである。にもかかわらず、相対的貧弱なグルテンタンパク質の消化性だけがCDを起こすのには不十分であるが、健康な個人とCD患者の間のこれらのタンパク質消化（非）能力の違いは知られていない。

1980年代、グリアジンの酵素消化物から分離されたペプチドのCD毒性に関する研究により、グルテンタンパク質の部分的に乏しい消化性に関する最初の洞察が明らかになった。したがって、最大30残基の長さのα-グリアジンのプロリンリッチアミノ酸配列に由来するペプチドは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、およびパンクレアチンに耐性があった[270,271]。その後、Shan等は免疫原性グリアジンペプチドα2（56-89）、いわゆる33-mer、およびγ5（26-51）、26-merペプチドは、すべての胃、膵臓、腸の刷子縁膜プロテアーゼによる分解に対して安定であることを実証した[272,273]。既知のアミノ酸配列に基づき、ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンによる小麦、ライ麦、および大麦の貯蔵タンパク質の仮想消化は、10残基を超える未消化の非常に多くのペプチドを残した[274]。残ったペプチドの最大長は次のとおりである：ω-、α-、γ-グリアジン：132、119、144。高分子量グルテニンサブユニット（HMW-GS）、低分子量グルテニンサブユニット（LMW-GS）：122、70; HMW-、ω/γ-セカリン：99、339; D-、C-、B /γ-ホルデイン：それぞれ130、118、74。高プロリン含有量は、タンパク質分解耐性にとっておそらく重要である。明らかに、人間は進化の過程でグルテンを十分に消化する能力を発達させていないため、高度に免疫原性の薬剤に直面している。要約すると、胃腸酵素に対するグルテンペプチドの高い耐性は、プロリンとグルタミンの後に胃酵素と膵臓酵素で切断できないことと、アミノペプチダーゼN、ジペプチジルペプチダーゼIV、およびジペプチジルカルボキシペプチダーゼIが長鎖ペプチドを消化するためのブラシボーダーメンブラン(刷子縁膜)にないことの2つの要因に帰することができる。以下に示すように、グルタミン側鎖の脱アミド化により、有害な免疫応答が増加する。数人の著者は、グルタミン含有グルテンタンパク質およびペプチドが、胃の酸性環境で部分的に脱アミド化される可能性があると仮定したが、証拠はない。明確化のために、α-グリアジンの免疫原性エピトープに存在するモデルペプチドPQLを、脱アミド化反応の可能性を研究するために、37℃で0.01mol / L HCl（pH 2.0）で240µm処理した[275]。その後の化学分析では、可能な脱アミド化生成物PELの痕跡さえ生成されないことが明らかになった。結論として、グルタミン含有グルテンペプチドの脱アミド化は胃で非特異的に起こるのではなく、TG2によって触媒される固有層で特異的に起こる。

in vitroの研究で人間の消化を模倣するために、いくつかのシステムが採用された[276]。たとえば、グルテン消化実験は、温度、酵素の組成とレベル、および期間が生理学的条件に適合しているビーカーまたはチューブで行われた。この単純なin vitroシステムは、グルテン消化の安定生成物としての33-merペプチドの同定に使用された[272]。 TNO（Wageningen、NL）によって開発された動的な胃腸モデルはより洗練されている。いわゆるTIM 1システムは、胃、十二指腸、空腸、回腸を模倣する4つのコンパートメントで構成されている[277]。 jacket動腸混合は、ジャケットの水圧を操作することによりシミュレートされる。このシステムは、真菌プロリルエンドペプチダーゼ（AN-PEP）によるグルテンの効率的な分解を実証するために使用された。
CD病態の現在の知識に基づいて、CD活性ペプチドの構造基準の次のセットを定義できる。
1.少なくともnine amino acid residuesの長さである。

2. 左利きのポリプロリンIIのらせん構造を採用するプロリン残基の含有量が高い。
3. TG2との脱アミド化およびアミド交換反応が可能な高含量のグルタミン残基をもつ。
すべてのグルテンタンパク質タイプには、これらの基準を満たす反復配列の形で配列セクションが含まれる。これらのタンパク質は、消化管酵素のペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンの消化力に直面する。問題は、CD活性のある消化生成物（ペプチド）が腸の刷子縁にどれだけ届くかである。次の計算の出発点は、1食あたり100gの穀物または全粒粉の平均経口摂取量であり、これは4つのCD毒性穀物の総タンパク質8.8〜10.6gに相当する[278]（表1.4）。総タンパク質に基づく貯蔵タンパク質の割合は、小麦、ライ麦、大麦で約75％、オート麦で14％（プロラミンのみ）[279]であるため、グルテン摂取量は1.39 g（オート麦）から7.95 g（小麦） 。表1.4に示すように、単一タンパク質タイプの割合は大きく異なり、その結果、例えば、少量のω5-グリアジン（239mg / 100g）と多量のγ-75k-セカリン（3168mg / 100g）が生じる。前述のように、CD活性の可能性のあるペプチドは、タンパク質の反復配列セクションにほぼ独占的に位置している。これらのセクションは、Bホルデインの合計配列に基づく30％からω-セカリンの96％の範囲の長さと比率で大きく変化する。結果として、C-ホルデイン（2471 mg）およびγ-75k-セカリン（2123 mg）は、グルタミンおよびプロリンが豊富な構造を最も多く提供するが、ω5-グリアジン（213 mg）、ω1,2-グリアジン（ 293mg）、およびD-ホルデイン（304mg）は非常に低レベルである。その後のin silico消化の条件は次の特異性があった：疎水性アミノ酸の前後のペプシンによる切断（例：X-L-X、X-F-X、ただしX = Pではない）、塩基性アミノ酸の後のトリプシンによる切断（例、K-X、R-X、X = Pではない）、および芳香族アミノ酸の後のキモトリプシンによる切断（例、F-X、Y-X、ただしX = Pではない）。 プロリンが豊富な構造は酵素攻撃に対してかなり耐性があり、反復配列のかなり高い割合（アベニンの11％除外した69〜100％）が > 8アミノ酸残基のペプチドとして生き残る。これらのペプチドの数と長さは大きく異なる。たとえば、Bホルデインの仮想消化では、2つのペプチドとxタイプHMW-GS 33ペプチドのみが得られた。ペプチドの最大長は、10残基（アベニン）から167残基（γ-75k-セカリン）の範囲である。これらの結果は、Shan et al., [273]およびOsorio et al., [274]が実施した研究と一致している。単一タイプに関しては、C-ホルデインは、全粒100gあたりペプチド2249mgおよびγ-75k-セカリン2123mgを放出する。驚くべきことに、最も免疫優勢のタンパク質としてしばしば特徴付けられるα-グリアジンは、γ-40k-セカリン（689 mg）、B-ホルデイン（588 mg）、およびγ-ホルデイン（1021 mg）と同様に中位（725 mg）にある。オート麦アベニンは、66 mgに対応する8残基を超えるペプチド（QPYPEQQEPF）を1つだけ提供する。要約すると、ライ麦はCD活性の可能性のあるペプチド（4304mg）の生産者としてリードしており、大麦（4132mg）と小麦（3162mg）がそれに続く。 CD毒性におけるオート麦の疑わしい役割は66mgの低レベルで十分影響される。

ペプチド代謝の次のステップは、構造的および定量的には不確実である。それらは刷子縁酵素によってさらに消化されないか？それらはタイトジャンクションを通過するか？それらはどのように経細胞経路中にエンドサイトーシスされ、固有層のTG2によって脱アミド化され、架橋されるのか？最後になったが、自然免疫および適応免疫応答のメカニズムにどのように適合するのであろうか？

6.2 上皮通路

腸管は栄養素の消化と吸収だけでなく、重要なバリア機能も持っている。上皮細胞の単層は通常、栄養素の吸収を可能にするが、細菌、ウイルス、およびその他の病原体などの有害物質の通過を制限する。腸の透過性の増加は、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、CDなどのいくつかの異なるヒト疾患に関連している。 粘膜透過性の変化は、刺激性グルテンペプチドに固有層の免疫系をさらすことにより、CDの発生における初期の病原性イベントであると考えられている。腸の透過性とバリア機能を制御する制御メカニズムの理解は、ここ数年で大幅に増加した。しかし、グルテンペプチドが腸の固有層にどのように到達するかはまだ完全には理解されていない。これは、傍細胞経路と経細胞経路の両方で発生するという証拠がある（図1.10のステップ2）。傍細胞経路を通過するグルテンペプチドは、粘膜下層に無修飾で到達するが、ペプチドは経細胞経路を介して分解される可能性がある。
傍細胞経路の最も重要な構造には、上皮の細孔形成「タイトジャンクション」（TJ）がある[170,280]。それらは、細胞内イベントによって調節される動的バランスにある。 TJは、連続的な帯状の細胞間接合を提供し、傍細胞透過性を調節する多くのタンパク質成分で構成されている。これらのタンパク質の機能は、バリア特性を強化する「引き締め」と、透過性を選択的に媒介する「漏れ」に細分できる。 TJの主要なタンパク質タイプは、オクルディン、クローディン、接合部接着分子A、およびトリセルリンと、細胞内プラークである小帯オクルーデンス（zonulin-1）の関連タンパク質である（図1.11）。 クローディンファミリーは、実際の傍細胞孔を形成し、オクルディンなどの他の膜貫通タンパク質と関連している。 クローディン-1、3、4、5、および8はバリアを強化するが、クローディン-2、7、10、および12はバリアを弱める。 ゾヌリン（ZO）-1およびZO-2やZO-3などの他の細胞質タンパク質は、接合部接着分子（JAM）に付着する。 オクルディンとZO-1は、アクチン細胞骨格と直接相互作用する。
ZO-1（プレハプトグロブリン-2 [281]として識別）は、腸炎ビブリオのオクルーデン毒素の腸上皮タンパク質アナログであり、通常、腸および他の上皮（心臓、脳）の表面に発現および分泌される。 ZO-1は、TJのタンパク質と迅速、可逆的、および再現可能な方法で相互作用し、それらを細胞骨格アクチンにリンクする。ゾヌリンは高分子の輸送に関与し、したがって、耐性/免疫応答バランスに関与する、これまでに記述された細胞間TJの唯一の生理学的モジュレーターとして特徴付けられている[282]。
腸のバリア機能の乱れは、腸の炎症の発症における重要な要因と考えられており、CDや炎症性腸疾患などの様々な腸疾患の発症と永続化の両方に重要な役割を果たしている[283]。プローブの透過性を決定する最も重要な要素は、その分子サイズである。健康な腸粘膜の孔径は、約50 nm（絨毛先端）から200 nm（クリプトベース）以上の範囲である。例えば豊富な単糖類（分子量≈180）はバリアを透過するが、代謝されない二糖類（分子量≈340）はバリアを通過できない。したがって、透過性の増加は、示差糖吸収試験によって測定できる[284]。この試験は、腸壁を特異的に通過するオリゴ糖（ラクツロースまたはセロビオース）および単糖（マンニトールまたはラムノース）の経口投与に基づいている。経口摂取後5〜6時間で収集された尿サンプル中の両方の糖の定量的比率は、バリア機能の喪失を最も正確に反映すると考えられている。
健康な人では、グルテンペプチドは腸細胞によってエンドサイトーシス(食作用)され、上皮輸送中にリソソーム系によってほぼ完全に分解される。したがって、局所免疫系の過剰な活性化は回避される可能性が高い[285]。アクティブCDでは、TJ（Tight junction）が開かれ、水平ストランドの減少とストランドの不連続性の増加が示される[286]。その結果、より多くのグルテンペプチドが腸粘膜を通過し、重要な画分が固有層に到達する。無グルテン食でも、最初に強化された腸管透過性は必ずしも正常に戻るとは限らない。腸のTJ(Tight junction)破壊の病原性の役割は、CD発症前に腸の透過性の増加が存在することを実証する研究によって裏付けられている。腸の透過性の増加は、無グルテン食を摂取している無症候性の患者で持続し、患者の健康な第一度近親者のかなりの割合にも存在する[280]。
ZO-1は、CDの病因の初期因子の1つであることが提案されている[282]。活動性CDを有する患者からの腸組織溶解物の定量的免疫ブロット法は、対照組織と比較してZO-1の増加を明らかにした[287]。 CDの急性期におけるZO-1のアップレギュレーション（発現増加）は、未治療のCDを持つ189人の患者の血清中のZO-1濃度を測定することによりさらに確認された[288]。健康なコントロールと比較して、彼らは病気の活動期の間に有意に高い濃度を持っていた。そして、それはグルテンを含まない食事の後減少した。 ZO-1アンタゴニスト（阻害剤）による腸管透過性の薬理学的調節により、CDの治療が可能になる可能性がある。

腸細胞の管腔側のケモカイン受容体CXCR3は、グルテンペプチドの標的腸受容体として特定されている。 CXCR3は活動的なCD患者で過剰発現し、ZO-1の放出の増加とそれに続く透過性の増加を誘発する[289]。 α-グリアジン合成ペプチドライブラリーを使用して、CXCR3に結合してZO-1を放出する2つのα-グリアジン20マーペプチド（QVLQQSTYQLLQELCCQHLWおよびQQQQQQQQQQQQILQQILQQ）が同定された。さらに、腸管透過性の増強は、活性化CD4 + T細胞によって産生されるサイトカイン、特にIFN-γによって引き起こされる可能性がある[290]。
傍細胞および経細胞輸送経路の相対的な寄与を分析するために、活動性CD患者から採取した十二指腸生検標本の標識グリアジンペプチドの透過性を、Ussing(ウッシング)チャンバーおよび特定の透過性マーカー（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マンニトール）によって比較した[291]。 無傷ペプチドの細胞内透過性は、ペプチドα57-68およびα202-220よりも、ペプチドα31-49および33-merペプチド（α2/ 56-88）の方がはるかに高かった。上皮を通過する無傷のα31-49および33-merペプチドの割合は、それぞれ25％および42％だった。傍細胞経路を介して腸を通過する無傷のペプチドの割合は無視できた。無傷のペプチドのこの異常な通過は、トランスフェリンおよび高分子IgA1の高親和性受容体であるCD71による抗グリアジン分泌IgA1とグリアジンペプチド間の複合体の異常なレトロトランスポートから生じた[285]。アクティブCDでは、CD71は腸細胞の頂点で大量にアップレギュレート（応答能増大）されて発現し、ルーメン(管腔)に存在するIgA1-ペプチド複合体に結合できる。この結合により、グリアジンペプチドはリソソーム分解を回避し、無傷で固有層に移行することができる。したがって、CD71はIgA1を免疫原性ペプチドの侵入を促進できる「トロイの木馬」に変換する[285]。 TG2はこのプロセスに参加する[292]。 CDが選択的IgA欠損症の患者に発生する可能性があるという事実は、このメカニズムに反する可能性がある。しかし、Heymanらは、IgGが同様の役割を果たし、新生児のFc受容体を介してペプチドを輸送する可能性があることを示唆した[293]。
活動性CDの患者の腸細胞におけるグリアジンペプチドの存在は、1998年にZimmerと同僚によってすでに実証されている[294]。免疫蛍光顕微鏡法を用いた形態学的研究により、対照腸細胞と比較して寛解状態のCD患者の腸細胞の細胞内区画にグリアジンペプチドの量が増加していることが示された。 CD患者のヒト十二指腸生検標本におけるさまざまなグリアジンペプチドの上皮内輸送プロセスは、エピトープ特異的モノクローナルAGA（Anti-gliadin antibody）を用いて研究された[295]。毒性ペプチドα31-49（LGQQQPFPPQQPYPQPQPF）および免疫原性ペプチドα56-68（LQLQPFPQPQLPY）を非活性対照ペプチドα229-246（LPQFEEIRNLALQTLPAM）と比較した。結果は、ペプチドα31-49がエンドソーム経路に沿ってペプチドα56-68およびα229-246から分離されたことを示した。したがって、ペプチドα31-49は、未治療のCD患者の標本でHLA-DR（D-related）陽性後期エンドソームをバイパス（回避）した。 HLA-DR陽性後期エンドソームに到達したペプチドα56-68およびα229-246とは異なり、初期エンドソームに局在していたため、基底膜での抗原提示を回避した。

したがって、ペプチドα31-49のエンドサイトーシス分離は、このペプチドがグルテン感受性T細胞を刺激できない理由を説明する。 これらの所見と一致して、Baroneと同僚は、ペプチドα31-43とα57-68の両方がCaco-2細胞（ヒト結腸癌由来細胞、カコツー細胞）とヒト腸生検に入り、エンドサイトーシス区画と相互作用することを発見した[296]。 しかし、ペプチドα31-43のみが腸細胞膜に局在し、エンドサイトーシスの成熟の重要なタンパク質である肝細胞成長因子調節チロシンキナーゼ基質（Hrs）を妨害した。 したがって、ペプチドα31-43は、CD患者の腸細胞におけるHrsを介した初期エンドソームの成熟を妨げることにより、小胞輸送を遅延させた。 健康な対照の生検では、ペプチドは小胞区分により容易に処理された。ペプチドα31-43は、細胞内輸送を変化させることにより、細胞表面のIL-15レベルを増加させた[297]。増加したIL-15タンパク質はIL-15受容体αに結合し、結果として陰窩腸細胞が増殖し、CD粘膜が早期に変化して陰窩過形成を引き起こした。さらにペプチドα31-43を含むリソソームの飲み込みは、細胞ストレスと酸化応答の生成を誘導し、これはTG2レベルの増加と関連している[298]。
結論として、最近のデータは、経細胞経路の重要な役割を示している。傍細胞透過性の増加は、むしろ絨毛萎縮と炎症性サイトカインの局所分泌の結果であるかもしれない[293]。ただし、CDの透過性の増加が病気の原因または結果であるかどうかの問題は、まだ答えられていない。

はじめに；

小麦粉を用いたパンの製造はグルテンタンパク質の特殊な粘弾性を利用した加工食品であり，そこでは加水量の少ない（小麦粉に対し1:2） 状態で吸水性の低いグルテンに水を加え、強い力を与えて混合し生じる強い粘弾性を用いた製パン方法である。一般にブラベンダーファリノグラフで500BUを目標に加水、撹拌して製パンに適した加水量をもとめる。この方法で得たドウを撹拌し，大気中の空気を気室の核としイーストによるガス膨潤、ベーキングするやり方が一般の製パン方法である。このグルテンタンパク質にはプロリン(17-23%)、グルタミン（35-37%）の多いエピトープがあり、患者はプロリルエンドペプチダーゼ（Peps）欠損のためにプロリンを含むペプチドを分解できないため小麦粉の病気、セリアック病をおこす。セリアック病はグルテンフリー食品（GFD）が唯一の治療法である。セリアック病以外小麦グルテン等のタンパク質に原因する小麦アレルギー、小麦不耐性の患者は何れもGFDが治療法である。ここではグルテンを他の天然の食材に置き換えて、同様の多孔質食品を作るのが目的である。

このためには粘弾性を有する天然食品材料を探すことが必要である。日本人は高温多湿の季節を乗り切るため、古来より種々な食材料の工夫を行って来た。腐敗を防ぐため発酵食品等が多く利用されてきた。その中には納豆食品のように粘度のあるものもあり，長い間には日本人はこのような粘性のある食品に慣れ、日本人の食生活の中には非発酵の粘性食品（例えばキノコ，野菜、海藻類）も多く好まれ食べられて来た。これらの粘性食材をグルテンに置き換えてその粘り性を利用してグルテンフリーパンを製造しようというのが目的である。ここで紹介するのは、ジネンジョ、ナットウ、ナメコ、オクラ、バナナ、モズク、ガゴメコンブの７種類である。

ジネンジョの場合；日本人の好む粘性食品にヤマイモがある。ヤマイモの独特の粘性を好むもので、ヤマイモはなまでも毒性がないためすりつぶしてそのまま食べる。この粘性食品を使って製パン性を行った。ヤマイモは世界中に600種ほどあるが日本にはこのうち４種類（ジネンジョ、ヤマノイモ、ヤマトイモ、ナガイモ）がある。４種のうち最も膨化するものを調べた。製パン方法；小麦粉で作ったパンと同程度の製パン性を得るためには、加水量、ミキシング時間などが非常に重要である。ここでは本論文で述べる一般的な製パン方法を述べる。粘性材料は凍結乾燥後粉体とした。デンプンは小麦デンプン大粒区分を用いた。小麦デンプン大粒はその形状がユニークで表面に多少の凹凸のある平板（10-20 μm）状である、この平板状の形態はドウ撹拌の時、空気の核を作るのに都合が良いと言われる。このため小麦デンプン大粒を使用した。粘性材料 10g、砂糖 8.86 gを９分間混合後、生イースト10g/10mL水を3.6Lボウル（a 3.6 L bowl using a kichen aid mixer ）中で9分間、116rpmで撹拌し、さらに小麦デンプン30gと水20 mLを加え同スピードで9分間撹拌した。ドウは全量、パンケース（5.5 x 9.5 x 6.6 cm）中にいれ、40℃で20分間発酵した。その後210 ℃で10分間ベーキングした。ベーキング後、パンはパンクラム、クラストの色（L, a, b値）、巣立ちの状態、パン高mm、比容積cm³/gから評価した。

The color (L, a and b values) of the breadcrumb was evaluated using an L, a, and b color specification system chromaticity diagram and a Hunter Lab Color Meter NE 2000 (Nippon Denshoku Co., Ltd., Tokyo, Japan).

Positive values for L, a, and b indicate white, red, and yellow, respectively.

製パン結果（表１）は、ジネンジョ粉；パン高68.4mm、3.95cm³/g、ヤマノイモ；38.2mm、2.41cm³/g,ヤマトイモ57.3mm、3.80cm³/g、ナガイモ粉；42.6mm、3.00cm³/gとなった。小麦粉パンはこのとき，69.4mm、3.45cm³/gであった。小麦粉に十分匹敵する製パン性がジネンジョ粉の利用で得られた（図１）。ジネンジョ粉の中の多糖類ガラクタンやマンナン等がグロブリン様タンパク質と結合して強い粘性を示した。ジネンジョ粉を水に対して透析すると透析外液（低分子量区分）と透析内液（高分子量区分）に分けることが出来る。高分子量区分分、低分子量区分で各々パンを焼くとパン高は22.8、 22.2mm、比容積は1.47、1.47cm³/gだったが、この両区分をもとの比率で混合するとパン高64.2mm、 比容積4.30cm³/gとなり製パン性は回復した(表２)。ミキソグラム試験から高分子区分のみではスムースなドウは出来ず、そこに低分子量区分を入れるとスムースなドウが得られた。発酵で発生したガスの保持力がドウで保たれ、その結果パン膨化力は増加したのであろう。さらに低分子区分をペーパークロマトグラフィーで糖質区分（0.37/1.1mg, 43.5%）とペプチド区分(0.48mg/1.1 mg,56.7%) に分け（図２）、糖質区分と高分子量区分、ペプチド区分と高分子量区分の製パン性は、パン高、33.3、56.2mm、比容積2.08、3.47 cm³/g夫々であった。ペプチド区分が製パン性は良かった。高分子量区分はガラクタンやマンナン等がグロブリン様タンパク質に結合したものでこれらの粘性ある多糖類がさらに低分量のペプチドの橋渡しで高分子量化して製パンに貢献したものと思われた。粘度のあるジネンジョを利用したグルテンフリーパンが製造された。

ナットウの場合；同様の粘性を有するナットウを利用したグルテンフリーパンを試験した。日本人は昔からボイルした大豆表面に、納豆菌（Bacillus subtilis ）を繁殖しこの菌の持つプロテアーゼ等の消化酵素を利用した食品を作って来た。納豆菌は大豆表面でムチンと呼ばれる強い粘性物質グルタミン酸ポリペプチドとフラクタンの混合物を生産する。水に溶けやすく粘性物質は市販のナットウから水抽出が可能で、凍結乾燥後ナットウパウダーを得ることができる。ナットウパウダー；水分含量12.5、粗タンパク質 21.7、炭水化物13.3、灰分8.7(%)である。ナットウパウダー1 g、小麦デンプン 30ｇ、砂糖8.86g、イースト10g、水15mLの仕込みで製パン試験したところ、パン高44.99mm、比容積3.40cm^３/gが得られた（小麦粉パン；パン高69.4比容積は3.45 cm³/g）。

ナメコの場合；

粘りのあるキノコのナメコ（Pholiota microspora (Berk. Sacc.)も日本人は好んで食べる。グルテンフリーパンにナメコの独特のぬめり、ゼラチン質の粘性物質のムチンを利用した。ナメコを粉砕後凍結乾燥して粉とした。ナメコ粉0.33g、小麦デンプン30.67g、砂糖8.86g、生イースト10g、水12.67mlの仕込みで、パン高49.30mm、比容積3.82cm³/gの製パン結果が得られた。ナメコの匂いは殆ど感じられずパン表面が多少破れやすく，巣立ちが荒いという欠点がある。

モズクの場合；

これに対し日本では粘度の高い海藻等も嗜好品として利用されて来た。沖縄など南西諸島産のオキナワモズク(Nemacystus decipiens)はアルギン酸やフコダイン等の粘質多糖類を含む。凍結乾燥モズク粉0.34g、小麦デンプン30g、砂糖8.86g、生イースト10g、水24.0mlの仕込みで、製パン結果はパン高56.08mm、比容積4.00cm³/gであった。

オクラの場合

オクラ（Abelmoschus esculentus）はペクチン質、ガラクタン、アラバン等の多糖類の関与する粘性を有する野菜である。凍結乾燥したオクラ粉1g、小麦デンプン30g、砂糖8.86g、生イースト10g、水20-21.7mlの仕込みで、製パン結果はパン高40.2mm、比容積2.93cm³/gが得られた。

バナナの場合；

日本では果物のうち最も多く輸入されているのがバナナである。バナナは数日中のうちに表面が黒変し果肉も変化し廃棄されるが、このとき生じる果肉の強い粘性を利用し、グルテンフリーパンを調製した。

未熟バナナを室温貯蔵した。5日後には黄色くなりこれまでのイモ状の果実はだんだんとやわらかくなり、食べごろに近づく。44日間おいておくと、果皮は真っ黒になる。その際の果肉は未熟なイモ状の時と比べるとやわらかくジャム状なるが腐敗はしない。これらの未熟から過熟までのバナナ果肉をそれぞれ、凍結乾燥し粉にして製パン試験を行った。各バナナ粉の一般分析値（表3）である。タンパク質含量の増加がみられたことから酵素の増加が推察された。

バナナ粉30g、砂糖8.86g、生イースト10g、小麦デンプン30gと水50mLを用いた。 製パン試験の結果である。左から、未熟バナナ粉、適熟バナナ粉、過熟バナナ粉を用いた結果である(図3 )。未熟バナナ粉と適熟バナナ粉では良好な製パン性は得られなかった。一方、過熟バナナ粉は、パン高67.1mm、比容積2.72cm³/gと小麦粉パンに近い製パン性を示した。また、パンクラムの明度を示すL値をみると、グリーンバナナ粉では55.0であったものが、ブラックバナナ粉では49.2に減少し、パンの黒色化を示した。こちらは各バナナ粉を用いたパン断面図です。過熟バナナはこのように十分な膨らみを示した。

過熟バナナのどのような成分が製パン性に影響を与えているのか検討した。過熟バナナを水に透析し、内液と外液に分けた。透析内液はデンプンや多糖類

及びタンパク質で構成されており、－15℃で凍結乾燥し、高分子区分（8.22g/30g, 27.4%）とした。一方、透析外液はペプチドや糖の低分子物質で構成され、65℃のロータリーエバポレーターで濃縮し、低分子区分(21.2 g/30 g, 70.7%)とした。

透析により高分子区分、低分子区分に分離したブラックバナナ粉を用いて製パンした結果を示した。その結果、両区分ともに単独では、製パン性はよくなかった。高分子量区分、低分子量区分を混合したものは、パン高69.6mm、比容積2.52cm³/gと、透析する前の製パン性と同程度の結果を示した(図 4)。黒バナナ粉30ｇあるいは高分子区分を水40mLに懸濁し、オートクレーブを用いて127℃で100分間処理した。オートクレーブ処理したものは、パン高38.6、比容積1.62となり、製パン性の低下が明らかとなった。また、L値は49.2から28.5まで減少し、これは加熱時のメイラード反応の起こったためと考えられた(表4)。これは、グリーンバナナとブラックバナナを偏光顕微鏡で観察したものである。グリーンバナナ粉のデンプン粒子は暗十字が観察された。しかし、ブラックバナナ粉のデンプン粒子は暗十字は観察されず、さらにデンプン粒子も消失していることが観察された(図 5)。熟成したバナナの大部分のデンプン粒子は消え、甘さが増し、また熟しすぎた細胞壁中の多糖類は分解され、その結果柔らかくなることなどが報告されている。

小麦デンプン2gと各バナナ粉2gを25mLの水と混合し、RVA試験をおこなった（図6）。4のプロフィールは小麦デンプンのみ4gのもの、5のプロフィールは小麦デンプンのみ2gのもので、他は小麦デンプン2gと各バナナ粉２gを混合したものである。まず、1のプロフィール（小麦デンプン2g+グリーンバナナ粉）を用いたものですが、この時のRVUは660で、小麦デンプンのみのRVU（630）とほぼ同じ値を示し、アミラーゼ活性の低いことが推察された。2（小麦デンプン２g＋イエロ--バナナ粉）と3（小麦デンプン2g+ブラックバナナ粉）は、１のグリーンバナナ粉と比較してそれぞれ最高粘度は204RVU、144RVUと減少した。熟成とともに，アミラーゼ活性が増える事を示した。

プロテアーゼ活性の影響を検討するために、ミキソグラフ試験を行った（図 7）。黒バナナ粉1gと小麦粉9gを水5.5mLと混合し、40℃で20分間インキュベーションし、ミキソグラフ試験をした。その結果、aのインキュベーションをしていないものより、わずかに粘性が低くなることが示された。このことから、ブラックバナナは小麦粉タンパク質の粘性を減少しているのではないかと推察された。過熟バナナの場合、このように酵素類の蓄積がグルテンフリーパンの膨化の鍵となっていると思われた。

オートクレーブ処理（127℃、100分間）でその製パン性は低下したが、その原因は甘味は増したが粘性物質は不明である。

ガゴメコンブの場合；  

これまでの食品材料に比べ、もっと粘度の高い材料ではどのような製パンが得られるか検討を加えた。日本人には昔からコンブを食べる習慣があった。北海道が産地である。コンブは多少粘度があり，アルギン酸やフコイダン等粘質多糖類を有している。コンブのうち北海道函館近辺でとれるガゴメコンブ（Kjellmaniella crassifolia Miyabe）は特に粘りの強いコンブとして知られている。このガゴメコンブを用いてグルテンフリーパンの製造を行った。

一般分析値は水分、粗タンパク質、脂質、灰分はそれぞれ10.13、11.79、0.58、17.11%であった（表 7）。これまでの粘性ある物質と同じように小麦デンプン8.86g、生イースト10g、水50mlで10g相当のガゴメコンブの凍結乾燥粉を使って、製パン試験を行ったがこれまでの様な製パン性は得られなかった。いろいろと試験するうちにガゴメコンブ量をずっと少量にして、300mg、生イースト10g、小麦デンプン30.5g、砂糖8.86gで加水量50mlの仕込みで行った結果、これまでのような膨化したグルテンフリーパンの製造ができた。この時ガゴメコンブ300mg加水量を18、20、22、24、26、28、30mlと増加すると，製パン試験結果はパン高、65.4、72.38、79.56、84.04、78.74、64.01, 63.81mm比容積、5.56、5.88、6.89、6.67、5.44、3.96、3.96cm³/gとなり、ガゴメコンブが0.3g, 22ml（加水量）のとき最もよく膨化した（図8）。ガゴメコンブ懸濁液を遠心分離（1,700 g for 10min）後、上清区分と沈殿区分に分けると、良好な製パン性は上清区分にあった。この製パン性はペプシンやエチルエーテル処理等では殆ど変化しなかったがオートクレーブ（127℃、100mm）処理は粘度の低下とともに製パン性も低下した（表 8）。ガゴメコンブ中のアルギン酸，ラミナリン、フコダインがグルテンフリー製パン性への影響が重要と思われた。

モズクの場合；

沖縄など南西諸島産のオキナワモズク(Nemacystus decipiens)はアルギン酸やフコダイン等の粘質多糖類を含む。凍結乾燥モズク粉340mg、小麦デンプン30g、砂糖8.86g、生イースト10g、水24.0mlの仕込みで、製パン結果はパン高56.08mm、比容積4.00cm³/gであった。ガゴメコンブほどではないが、少量でグルテンフリーパンが得られた。

さいごに；

グルテンフリーパンのための小麦代替材料は天然物の粘性物質を探した。日本には多くの粘性食品があり、これらはいずれも食品衛生的に安全である。バナナの過熟した物は、果物としては価値のないものを有効に利用できる。さらにガゴメコンブやモズクなどは極めて少量でその機能が示された。

5  診断
診断は複雑であり、高レベルの臨床的疑惑を必要とする傾向があるため、CDは西洋人集団で最も診断不足の状態の1つである。 CDの正確な診断は、CDの疑いのある個人にとって非常に重要である。偽陽性の結果は、個人に無制限の生涯にわたる無グルテン食を強いることになる。これは、被災者とその家族の両方にとって大きな課題である。偽陰性の結果は、CD患者の潜在的な健康障害を負わせる。特に重篤な症状のある患者の診断の遅れは、主に悪性腫瘍による長期合併症のリスクと死亡率の増加に関連するため、避けるべきである[179]。しかし、残念なことに遅延は一般的であり、診断前の症状の平均持続期間は4.5年から11年である。さらに、患者の4分の1は、診断が行われる前に3人以上の医師に相談する必要がある[180]。 CDはさまざまな腸外症状を伴うため、患者は、皮膚科医、リウマチ専門医、歯科医、内分泌専門医、神経科医などの小児科医や消化器専門医以外のさまざまな専門家に診察される。

CD関連の合併症の一部は、CDが時間内に治療されない限り、元に戻せない場合がある。たとえば、成長遅滞、骨粗鬆症、および異常な歯列は、早期に治療しなければ永久に残る。これらの理由から、集団検診に適したCDが提案されている。ただし、広範な集団スクリーニングの役割については議論の余地がある。特に、無症候性の人に対するスクリーニングの利点は、健康状態の増加が無グルテン食への遵守の負担を上回るかどうかは不明であるため、依然として議論の対象となっている。集団検診に対する賛成論と反対論は、Aggarwalと同僚によってまとめられている[177]。現在、第一度近親者または他の近親者が生検で確認されたCDを持っている人には、スクリーニングが推奨されている。 CDに関連することが知られている自己免疫疾患のある人もスクリーニングの候補である。今後の研究では、無症候性患者のCD診断の実際的な利点に焦点を当て、診断前後の生活の質の測定および無グルテン食の導入に重点を置くべきである[177]。大量スクリーニングの効果的な代替法は、微妙な症状または非定型症状のみを抱え、リスクグループに属する個人の間での血清学的スクリーニングによる積極的な症例発見である。教育と医療従事者の意識向上を伴うこのアプローチにより、フィンランドの一般集団で多数のCD患者が検出された[181]。

診断のアプローチは、CDの病態機構のより良い理解と、より敏感で特定の血清学的検査の利用可能性のために、ここ数十年の間に変化した。要約すると、診断スキームは以下で構成されている（図1.9）。
1.病歴と症候学;
2.血清学的検査;
3.小腸生検での組織学的所見;
4.グルテンを含まない食事に対する臨床的および血清学的（必要に応じて組織学的）応答。
スクリーニングの候補者も同じ手順に従う必要がある。遺伝的HLA検査はCDの初期評価には示されていないが、例えば、症候学と血清学の間の矛盾または曖昧な小腸生検のためにCD診断が論争のある場合、例えば、症候学と血清学の間の矛盾またはあいまいな小腸生検のため役立つ可能性がある。

プライマリケア医（何でも診る専門医）は診断のプロセスで中心的な役割を果たす。 CDのよく知られた症状は、医師に血清学的検査の開始を促すはずである。さらに、自己免疫疾患およびCD患者の第一度近親者が血清学的検査のために考慮されるべきである。診断手順の進め方は異なって評価される。米国消化器病学会は、CDの疑いのある人の診断を確認するために腸生検を義務付けている。対照的に、2004年のコンセンサス声明では、米国国立衛生研究所は、血清学的所見が陽性である場合、または血清学的結果が診断的でない場合にのみ生検を推奨している[101]。 ESPGHANは以前、次の3つのステップを推奨していた。
1.生検→扁平粘膜;
2.無グルテン食、生検→寛解状態の粘膜。
3.グルテンチャレンジ、生検→扁平粘膜。
チャレンジは平均3〜4週間実施する必要があり、1日に３−4枚の小麦パンをテストする。 3つの生検を含むこのような患者の負担と時間のかかる手順が必要かどうかの問題により、1990年にESPGHANは、グルテンの場合、グルテンチャレンジは必須ではないことを示唆した（2歳未満の子供を除く）。無食は生検標本の症状と形態の良好な改善をもたらした[182]。
2012年、ESPGHANは診断ガイドラインの別の改訂版を発表した[183]。主な結論は、CDの診断は
1.グルテン依存症状;
2. CD特異抗体レベル。
3. HLA-DQ2またはHLA-DQ8対立遺伝子の存在;
4.十二指腸生検における組織学的変化（絨毛萎縮および陰窩過形成）。
前のガイドラインの修正において、IgA TGA（Anti-transglutaminase antibody）力価が高い場合（> 100 U / ml =>正常の上限の10倍）、十二指腸生検は省略できる。特に子供の場合、生検を省略することで、全身麻酔による内視鏡検査の負担と、この手順の潜在的な悪影響を回避できる。新しいESPGHANの証拠に基づくガイドラインは、選択された症例では生検をスキップすることを推奨していないが、医師が単にそうすることを許可していることに注意しなければならない。クラップと同僚たちの研究は、TGA（Anti-transglutaminase antibody）に対して症候性で陽性の選択された小児において、組織学的所見とは無関係にCD診断を確立できるという見解を支持した[183]。しかし、他の研究では、EMA(Anti-endomysium antibody)およびTGAが陰性の小児の予期せぬ頻度の症例が報告されたが、陽性の組織学[184]およびカットオフ（病態識別値）TGAレベルは100％の陽性CD予測値[185]に関連することが見出されなかった。したがって、確認的な腸生検の必要性がまだ存在する可能性がある。すべての場合において、腸粘膜の回復とグルテンを含まない食事での治療後の血清学的検査陰性は、CDの診断の重要な証拠である。

生検が必要な場合は、バルブの1つを含む少なくとも5つの標本サンプルを収集する必要がある。これが唯一の影響を受ける部位である可能性があるためである。Marsh 3による絨毛萎縮は、以前はCDの診断を設定するために必要だったが、新しいESPGHANガイドラインは、Marsh 2もCD診断に十分であると結論付けている[186]。診断が確立され、グルテンフリーの食事が導入された場合、CDの追跡と管理のために繰り返し血清学的検査が推奨される。無症候性の患者では、グルテンを含まない食事下での2回目の生検で粘膜の組織学的回復を証明することが推奨される。

CDの診断は、患者がグルテンを含む食事をしている間に行う必要がある。したがって、診断プロセスが終了するまで、通常のグルテンを含む食事を摂取する必要がある。これは、家族がCDと診断されているため、グルテンを含まない食事を摂っている家族には特に強調されるべきである。さらに、多くの患者は、適切な診断検査の前に無グルテン食を開始する。そのような場合、血清学または生検による診断の正確性に対するグルテン離脱の影響は、グルテンを含まない食事の期間と厳格さに依存する。診断結果が不明確な場合は、血清学的異常と特徴的な腸の損傷を再現するのに十分な期間、グルテンを食事に再導入する必要がある[187,188]。一部の患者ではグルテン攻撃に対する重度の反応が起こる可能性があるため、グルテンを徐々に増やすことをお勧めする。患者は、1日に3〜4枚の小麦パンで3〜4週間チャレンジする必要がある。症状が再発しない場合、抗体測定を使用して腸生検のタイミングをガイドすることができる。しかし、グルテンを含まない食事を長期間続けた患者は、グルテンが再導入された後、血清学および粘膜組織学の再発に数年かかる場合がある。
CDの診断に対する患者の反応は異なる。古典的な症状のある患者の大部分は、CDと診断され、その状態での生活に適応していることに満足している[189]。ただし、画面で検出された無症候性の人および腸管外症状のある人は、古典的な症状のある人よりも診断を否定的に経験した。古典的な症状なしに診断された少数の患者は、診断されたことを後悔した。