2.代替療法
生涯にわたる厳格なGFDであるCDの従来の治療は、CD患者にとって大きな課題であり、コンプライアンスの低下やグルテンの不注意な摂取につながる可能性がある。したがって、安全で効果的な代替案を開発する緊急の必要性がある。ただし、代替治療は、GFDと競合する安全性プロファイルを備えている必要がある[34]。新しい治療法はまだ開発の初期段階にあり、効果的な物質や治療法がヒトに使用される前に、広範な毒性試験が必要になるであろう。過去数十年の間にCDの病態メカニズムに関する知識が大幅に増加したため、CDの予防と治療のための多くの新しい戦略が開発された。それらのほとんどは、消化過程と粘膜透過性への介入、酵素とサイトカインの阻害、および受容体の遮断で構成されている。 CDの新しい非食事療法のリストは、いくつかの総説[35-38]に示されている。可能な治療のための病原性標的の簡略化されたスキームを図3.1に示した。 CDの新しい代替治療の有効性をテストするための第II相臨床試験はすでに進行中である。ただし、治療候補者を第III相試験に入れる前に、研究者は、患者に関連する結果を正確に反映する、腸の損傷および疾患活動性の新しい信頼できる非侵襲的代理マーカーを開発する必要がある[38]。
2.1　経口酵素療法
通常、食品タンパク質は、胃、膵臓、刷子縁の酵素によって小さなペプチドと遊離アミノ酸に分解される。ただし、特にアミノ酸配列の反復セクションでのプロリン含有量が高いと、グルテンタンパク質は完全なタンパク質分解消化に対して非常に耐性がある。グルテンタンパク質の免疫原性および毒性活性を無効にする酵素分解は、経口療法への魅力的なアプローチである（図3.1の1番）。グルテンの解毒のための戦略は、CD毒性タンパク質を9未満のアミノ酸残基を含むべき非毒性フラグメントに加水分解する特別なペプチダーゼによる経口治療に基づいている。他の治療法と比較した場合の経口酵素療法の利点は、外因性グルテンが内因性エフェクターではなく治療の標的となることである[39]。 グルテンを酵素で解毒する最初の試みは、ブタの腸粘膜の新鮮な抽出物[40]またはパパイヤ果実からの粗パパイン[41]とのインキュベーションによって行われ、さらなる開発は進んでなかった。注目すべきことに、パパインは通常胃腸ペプチダーゼに耐性のあるCD毒性ペプチドのQ-Qペプチド結合を切断することが示されている[42]。長い休憩の後、このCD研究分野のルネッサンスは、21世紀の初めに始まった。それは主にバクテリア、菌類、発芽中の穀物からのペプチダーゼに焦点を合わせてきた。 Shanらは、グルテンの解毒のためにいわゆるプロリルエンドペプチダーゼ（PEP）を最初に導入した[43]。 PEP（EC 3.4.21.26）は、セリン型ペプチダーゼのSCクランに属するS9Aペプチダーゼファミリーに分類される。詳細な構造的特徴は、Osorioのグループによって説明された[44]。 PEPはさまざまな微生物で発現し、グルテンタンパク質の免疫原性プロリンリッチセクションを切断することができる（プロリン切断後酵素）。最初に、Flavobacterium meningosepticum、Sphingomonas capsulata、およびMyxococcus xanthusからの3つの細菌PEPが使用された。いくつかの欠点（例えば、低pHおよびペプシンに対する感受性、無傷のタンパク質を分解するための追加の酵素の必要性、長い反応時間）のために、S.capsulataからのPEPは大麦粒[45]からのグルタミン特異的システインエンドプロテアーゼ（EP-B2）と組み合わされた。この2酵素カクテルは、中性培地と酸性培地の両方で活性があり、ペプシンに耐性があり、シミュレートされた十二指腸状態から数分以内にグルテンを分解した。 PEPとEP-B2を組み合わせた準備はALV003と呼ばれ、3つの第I相および第IIa相臨床試験で評価された。一般に、それは安全で忍容性が高く、用量制限毒性がないことがわかった。さらに、この製剤は、十二指腸コンパートメントに到達する前に、主に胃でグルテンを分解するのに非常に効果的である。 ALV003は現在、20人の患者を対象としたさらなる第II相試験で調査されている。 Gordonらは、酸性条件下で非常に活性の高い好酸性細菌Alicyclobacillus sendaiensisからクマモリシン-Asというエンドペプチダーゼを同定した[46]。初期の酵素特異性は、CDで免疫原性のペプチドで頻繁に発生するペプチド結合P-Qに向けた計算設計によって変更された。操作された酵素（KumaMax）は、モデルグルテンテトラペプチド（PQLP）で野生型酵素よりも116倍高いタンパク質分解活性を示し、グルテンペプチドの免疫原性部分に対する基質特異性が800倍以上切り替えられた。 KumaMaxとインキュベートしたグリアジンペプチドα9/ 57-68（QLQPFPQPQLPY）の半減期は8.5分と計算された。この酵素は酸性条件下で非常に活性が高く、ペプシン（pH 4）およびトリプシン（pH 7）に耐性がある。これらの組み合わされた特性により、操作されたペプチダーゼは経口剤として有望な候補になる。乳酸菌も複雑なペプチダーゼシステムを持っていることが知られている。小麦とライ麦のサワードウは特に乳酸菌が豊富で、それらのいくつかはプロリンが豊富なタンパク質とペプチドを加水分解することができる特定のペプチダーゼを持っている。サワードウ乳酸菌とビフィズス菌の混合物（単一株ではない）を使用した研究（調製VSL＃3）は、プロリンに富むタンパク質とペプチドを分解するために複雑なパターンのペプチダーゼが必要であることを示している[47]。乳酸菌と真菌ペプチダーゼの組み合わせ（以下の議論を参照）は、グルテン毒性の排除に新しい視点をもたらすものとして提案されている[48]。さらに、グルテンの毒性作用を低減する別個のプロバイオティクスビフィズス菌種の能力は、細胞培養アッセイを使用して示された[49]。これらの影響に対処する最初の臨床試験が発表された。ヒトの口腔内の歯垢に由来する微生物酵素も、グルテン由来のプロリンに富むペプチドを加水分解することが示された[50]。 真菌ペプチダーゼの中で、Aspergillus niger（AN-PEP）のPEPは、グルテンタンパク質とペプチドを非常に効率的に分解することが示されている[51]。この酵素は、pH 4〜5で最適に機能し、pH 2で安定した状態を保ち、ペプシンによる消化に対して完全に耐性がある。バクテリアのPEPよりもはるかに速く無傷のグルテンタンパク質とT細胞刺激ペプチドを分解する。もう1つの利点は、アスペルギルス属の菌株が食品グレードのステータスを持ち、組換えAN-PEPを工業環境下、低コストで製造できることである。 AN-PEPは、胃や小腸に見られる状態を模倣した動的な胃腸モデルを使用して、パンのスライスや食事全体でグルテンを消化することが示されている。グルテンの消化はすでに胃で起こり、免疫原性エピトープはほとんど小腸に到達しない[52]。 AN-PEP製剤の臨床試験は広く進んでいる。 A. niger（アスペルギルスペプシン）とA. oryzae（ジペプチジルペプチダーゼIV）からの他の2つの食品グレードのペプチダーゼの組み合わせも、適度な量のグルテンを無害化することができる[53]。両方の酵素からなる酵素製剤（STAN 1）は、現在CD患者を対象に臨床試験が行われている。発芽中の穀物の内因性ペプチダーゼは、貯蔵タンパク質を広範囲に分解できることが長い間知られている。発芽したライ麦ふすまから抽出されたペプチダーゼは、無傷の小麦、ライ麦、大麦のプロラミンとグルテリン、およびCD毒性グリアジンペプチドを高度に分解することが示された[54]。エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの複雑な組み合わせである酵素は、pH 3から9の間で活性があり、pH 4.5から50°C、およびpH 6.5で50°Cから60°Cの間で最適に達する。 CD毒性のグリアジンペプチドは、9アミノ酸残基未満の断片に切断される。グリアジンからの消化性トリプシン消化物を発芽小麦粒から単離されたペプチダーゼで処理すると、T細胞増殖および器官培養試験によって示されるように、CD毒性が失われた[55]。発芽穀物ペプチダーゼを用いたヒトの生体内研究はまだ行われてないが、酵素は自然に安全な食物源に由来し、遺伝子工学は必要ないという明確な利点があるため、この潜在的なタイプの治療法をさらに発展させることができる。それらの生産は、確立された技術プロセス（穀物の麦芽製造、ビールの醸造）の一部であるため、シンプルで安価である。
以前の研究[40]の続きとして、ブタ十二指腸粘膜からのペプチダーゼを使用する酵素療法が提案されている[56]。 CD患者は毎日適度な量のグルテンでチャレンジされた。酵素製剤（「グルテニン」のカプセル）をグループの半分に投与し、プラセボを残りの半分に投与した。 CD症状、血清抗体、および十二指腸粘膜の組織学は、プラセボ群と比較して酵素療法中に改善されることが見出された。コムギ虫(sunn pest, Eurygaster ssp)のペプチダーゼも、グルテンタンパク質の広範な分解の可能性があることが示された[57]。 これらすべての酵素療法に関して対処しなければならない重要な問題は、特定の酵素用量によって生体内で効果的に無害化できるグルテン用量である[37]。経口酵素療法はおそらく、通常の毎日の摂取であるグルテンのグラムを十分に分解することはできないが、GFDに存在するグルテン汚染の有害な影響を排除することができる。対処する必要のある2番目のポイントは、酵素療法の効率に対する他の潜在的に競合する食事性タンパク質の影響である。最後に、酵素送達の代替法（経口カプセルを介した食事ごとに1回）は、改善された投与スケジュールと送達経路を使用して調査することができる。
2.2　グルテン封鎖ポリマー
生体内でグルテンを解毒するための代替戦略は、グルテンの高分子樹脂への結合に基づいている（図3.1の2番）。 In vitro研究では、ヒドロキシエチルメタクリレートとナトリウム4-スチレンスルホネートの線状高分子量コポリマー、P（HEMA-co-SS）が、シミュレートされた胃および腸の条件下でグルテンタンパク質に結合することが示されている。 また、培養中の細胞に対するグリアジンの有害な影響を無効にした[58]。 ただし、グルテン以外の多くの他の栄養タンパク質はポリマーと相互作用し、CD患者でのその活性を制限した。 将来の臨床試験では、生体内でのポリマーの安全性と、特定の用量のポリマーによって効果的に無害化できるグルテンの用量を確立する必要がある。
2.3　 プロバイオティクスバクテリア
CDは、疾患の炎症誘発性環境に寄与する腸内細菌叢の変化に関連している。異なるビフィズス菌はグルテンの毒性作用を減らすことがわかっている[59]。これらの発見は、ビフィズス菌の既知の免疫調節特性とともに、これらのプロバイオティクスをCDの代替療法に発展させる可能性を開いた（図3.1の3番）。これらの細菌の正確な作用機序は不明なままであるが、未処理のCDにおけるビフィズス菌の影響に対処する最初の臨床試験が発表された。
2.4　透過性阻害剤
活動性CDの患者は、密着結合（tight junction）構造分析によって測定されるように腸透過性が増加している。ゾヌリンは、上皮透過性の重要な調節因子として同定されている。グルテンペプチドがケモカイン受容体CXCR3に結合した後、ゾヌリンが放出され、腸透過性が増加する。この観察により、ゾヌリンの阻害に基づくCDの新しい治療オプションがもたらされた（図3.1の4番）。目的は、傍細胞透過性を低下させることにより、免疫原性ペプチドが腸細胞層を通過するのを防ぐことである。候補の1つは、ゾヌリンの受容体結合モチーフによって共有されるアミノ酸配列を含むオクタペプチドである酢酸ララゾチド（AT-1001）である。 AT-1001は、受容体遮断を介してゾヌリン作用に拮抗するため、粘膜機能障害を予防する。 この治療薬は、寛解期にある14人のCD患者でテストされた。これらの患者はすべて、グルテンチャレンジ後もサイトカイン産生を増加させることなく腸透過性を維持していた[60]。 フォローアップのランダム化二重盲検プラセボ対照第II相試験では、AT-1001は、プラセボと比較した場合、安全で忍容性が高く、炎症性サイトカイン産生が減少し、毎日2.5--グルテンのg用量（ドース）を投与された患者の胃腸症状が減少したことが示された[61]。 ただし、グルテン由来ペプチドの経細胞経路に対するAT-1001の影響は調査されてない。
2.5 トランスグルタミナーゼ2の阻害
TG2はCDの適応免疫応答において重要な役割を果たす。 TG2によって触媒される特定のグルタミン残基のグルタミン酸残基への変換は、ヒト白血球抗原（HLA）-DQ分子に対するグルテンペプチドの親和性の増加をもたらし、したがって、T細胞刺激の増加をもたらす。したがって、TG2の選択的阻害は、CDの効果的な治療アプローチとなる可能性がある（図3.1の5番）。 TG2のいくつかのタイプの競合的、可逆的および不可逆的阻害剤が、CDおよび他の疾患（例えば、癌）の治療のための潜在的な薬剤として提案されている[62-64]。これらには、チアジアゾール、エポキシド、α、β-不飽和アミド、およびジヒドロイソオキサゾールなどの不可逆的阻害剤、ならびにチエノピリミジン、シンナモイル化合物、β-アミノエチルケトン、およびアシリデンオキシインドールなどの可逆的阻害剤が含まれる。それらのいくつかは、動物およびヒトの生検検査を使用してCDの特異性について研究されている。たとえば、シスタミンは、CD患者からの小腸生検グルテンのチャレンジ後のT細胞応答の低下につながる [65]。 2-[（2-オキソプロピル）チオ]イミダゾリウム誘導体（L-682777、R-283）は、ヒトTG2を阻害し、病原性グルテン感受性T細胞の活性化をブロックする[66]。概念実証研究では、2つのTG2阻害剤、細胞不透過性R281と細胞透過性R283が、invitroでグリアジンの毒性作用を防ぐことができるかどうかを調査した[67]。結果は、阻害剤が特定のグリアジン誘発効果を低減できることを示唆した。ジヒドロイソキサゾール化合物（例えば、KCC009）は、忍容性が高く、TG2を効果的に阻害することが示されている[68]。それらは血清半減期が短く、他の臓器のそれらへの曝露を制限する。用量依存的にTG2の活性化を不可逆的に遮断するチオレドキシンは、別の興味深い治療選択肢となる可能性もある[69]。ただし、TG2阻害は、適応応答でアクティブなすべての免疫原性エピトープを完全に排除するわけではなく、自然免疫応答はまったく防止されない。さらに、TG2は体内で遍在的に発現するため、TG2阻害に基づく新薬は、小腸で選択的に作用するように設計する必要がある。今日、臨床試験は計画段階にある。
2.6 HLA-DQブロッキング
免疫原性グルテンペプチドは、抗原提示細胞の表面にあるHLA-DQ分子に結合し、T細胞の活性化を促進し、その後、適応免疫応答を促進する。 HLA-DQ2 / 8の結合部位をブロックすると、提示プロセスが抑制され、CD処理への別のアプローチが提供される（図3.1の6番）[70]。デュラムコムギ由来のデカペプチド（QQPQDAVQPF）は、CD患者の小腸粘膜を使用してin vitroでグリアジンに拮抗作用を及ぼすことが示された[71]。末梢血単核細胞に関する研究は、ペプチドの効果が免疫刺激剤Tヘルパー（Th）1からTh2表現型へのT細胞応答のシフトに基づくことを提案した[72]。適応免疫を活性化するグリアジンペプチドに基づいて、さまざまなタイプのペプチドブロッカーが開発されている。それらは、ネイティブのグリアジンペプチドよりもDQ分子に対してはるかに高い親和性（最大200倍）を持っているが、T細胞受容体によって認識されない。これらのアンタゴニストには、環状および二量体ペプチド類似体、プロリン残基がアジドプロリン残基で置き換えられたペプチド、および結合を増強するN末端およびC末端配列に隣接するノナペプチド類似体が含まれる[73,74]。アルデヒド含有グルテンペプチド類似体も、緊密に結合するHLA-DQ2リガンドとして設計された[75]。アルデヒド基は、シッフ塩基の形成を通じて、DQ2結合ポケット内の活性リジンをブロックすることができる。 DQ2ブロッキングは、残基L11とL18が立体的にかさばる基で置き換えられた33merのペプチド類似体によっても達成された[76]。ポジショナルスキャニングノナペプチドライブラリー使用により、DQ2結合フレームの各位置に最適なアミノ酸残基を組み合わせることにより、新しい高親和性ペプチドリガンドが設計された[77]。新しいペプチドライブラリベースの方法が提示され、HLA-DQ2.5に結合する高親和性リガンドの同定とペプチド結合モチーフの洗練された定義が可能になった[78]。これらの化合物が非毒性、非免疫原性であり、免疫応答を完全に抑制できるかどうかはまだ確立されていない。また、管腔の免疫原性グルテンペプチドと競合しながら、修飾ペプチドが固有層の標的細胞にどのように到達するかについての懸念が存在する。さらに、特定の免疫応答を調節するためにペプチド類似体を使用することに成功する可能性は、グルテン感受性T細胞エピトープの幅広い不均一性によって妨げられる可能性がある[79,80]。
2.7 炎症の調節
T細胞の活性化は、CDの病因の基礎の1つと見なされている。グルテン感受性エフェクターT細胞の血液から小腸粘膜への移動は、ケモカインCCL25とその受容体CCR9によって誘導される。選択的アンタゴニストによるCCL25 / CCR9相互作用の遮断は、T細胞の腸固有層への移動を防ぎ、CDの治療戦略と見なされてきた。 T細胞のCCR9受容体を阻害する拮抗薬CCX2282B（Traficet-EN®）およびCCX025は、クローン病およびCD用に開発されており、現在、臨床試験が実施または計画されている。 サイトカインに対する抗体は、CDを治療するための将来のアプローチである可能性があることも示唆されている（図3.1の7番）。グルテン感受性T細胞の活性化が多くの異なるサイトカインの分泌につながることはよく知られている。次に、炎症反応のカスケード（連鎖反応）が引き起こされ、粘膜損傷と絨毛萎縮を引き起こす。したがって、特定のモノクローナル抗体によるサイトカインの遮断は、それらの活性化を妨げる可能性がある。いくつかの抗体（例えば、インターフェロン（IFN-）γ（フォントリズマブ）、（ビシリズマブ、テプリズマブ、オテリキシズマブ）、CD20（リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ）、およびインターロイキン（IL-）15（AMG 714））は、さまざまな自己免疫疾患およびCDの治療のために臨床評価を受けている[36,37]。腫瘍壊死因子（TNF）-α（インフリキシマブ）に対する抗体の使用は、過敏性腸症候群および難治性CDの患者に有益であることが示されている。 IL-15またはそのシグナル伝達経路を遮断すると、特に難治性CD IIを制御し、進行性T細胞リンパ腫への進展を防ぐのに役立つ可能性がある。
2.8 ワクチン
CDの代替療法の最も求められている目標の1つは、ほとんどの免疫優勢グルテンエピトープのパネルで構築された治療ワクチンの開発である。この戦略は現在、アレルギーと自己免疫疾患の両方について評価されており、有望な結果が得られている[81,82]。 CD患者に「寛容原性」反応を誘発することを目的として、α-およびγ-グリアジンとホルデインから選択された3つの免疫原性16-merペプチドの混合物に基づいて、脱感作ワクチンまたは治療ワクチン（NexVax2）が開発された。ペプチドはHLA-DQ2によってのみ提示されるため、ワクチンはHLA-DQ2ハプロタイプの患者にのみ適している。この方法による皮下免疫は、忍容性が高く、かなり安全であることが示され、患者のボランティアに深刻な悪影響を及ぼしたことはない[83]。さらなる臨床試験では、小麦、ライ麦、大麦のタンパク質に含まれる多数の異なる免疫原性エピトープを考慮して、このワクチン接種アプローチの有効性を評価する。ワクチン療法は、免疫系の活性化とその結果としての病気の再燃のリスクに関連している可能性があることに注意する必要がある。
2.9 フックワーム療法
自己免疫疾患とCDの治療法として、アメリカ鉤虫の蔓延が示唆されている（図3.1の8番）。 この寄生虫は、宿主の免疫系を調節する上で重要な役割を果たしていると考えられている。たとえば、炎症性Th1応答を攻撃性の低いTh2応答に偏らせることによってである。 プラセボ対照臨床試験では、CD患者にアメリカ鉤虫を接種した後、高用量のグルテンを投与した[84]。 残念ながら、感染は腸粘膜の劣化やグルテンに対する免疫応答を防ぐことができなかった。 将来の試験では、この治療法が過去の治療法よりも少量のグルテンに対してよりよく保護できるかどうかが示される可能性がある。
2.10 治療効果のモニタリング
CDの代替治療の有効性を評価するには、特定の感度の高い方法が必要である[37]。 CDの真正な動物モデルは発見も設計もされていない。したがって、治療効果のアッセイは、invivoおよびinvitro試験、および代理動物モデルによって実施される[39]。グルテンチャレンジ後の腸生検の組織学的変化は、CD毒性を評価するための「ゴールドスタンダード」となる。ただし、この手順は主観的であり、侵襲的で費用のかかる内視鏡検査が必要なため、臨床試験での実装は非常に困難である。 CDに関連する症状は非常に多様であるため、症状スコアもこの目的には適していない。おそらく、短期間のグルテンチャレンジ後に血流に入るCD特異的T細胞の測定[85,86]は、新薬候補の初期の臨床試験に採用することができる[87]。小腸器官培養法がCDの病因を明らかにすることを目的とした研究で広く使用されていることを考えると、この方法が新しい治療形態に関連するいくつかの研究でのみ使用されていることは驚くべきことである[88]。血清抗体の感度は不十分であり、腸透過性の測定は、特に低から中程度のグルテンチャレンジの影響を監視する場合に特異的ではない。 動物モデルのより良い利用可能性は、新しい治療戦略を開発している研究者によって高く評価されるであろう。 ただし、最も顕著な制限は、機能的なCD固有の動物モデルの欠如である[88]。 したがって、薬剤開発は現在、疾患活動性を測定するための特定の感度の高い方法の欠如によって妨げられている。
2.11 おわりに
現在、CDの唯一の治療法は、GFDを生涯にわたって厳守することである。これにより、有害な副作用を引き起こすことなく、病気を明確に防ぐことができる。 ただし、GFDは保守が難しく、費用がかかる。そして食事療法へのコンプライアンスが悪い場合がある。したがって、CD患者は、厳密なGFDよりも負担の少ない代替治療または補完治療への要望を表明している。 CDの病因に関する知識の向上により、研究者は障害を治療するための代替戦略を開発することができた。新規治療の有効性をテストするための第II相臨床試験はすでに進行中である。現在の多くの臨床研究は有望な結果を示しているが、これらの研究は期間が短く、重要性が低い [89]。したがって、すべてのアプローチの有効性と長期的な安全性の両方を評価するには、より長い期間とより重要な研究が必要になる。治療候補者が第III相試験に参加することを許可する前に、研究者は、臨床試験の結果を正確に反映する、腸の損傷および疾患活動性の新規で信頼性の高い非侵襲的代理マーカーを開発する必要がある[38]。取り組むべき重要なポイントは、生体内で無害化できるグルテンの量である。これにより、各治療により、患者がグルテンを自由に摂取できるのか、控えめな量だけ摂取できるのか、あるいは微量のグルテンに不注意で遭遇した場合に単に炎症を回避できるのかが決まる[39]。最初に入手可能になった医薬品は、代替品ではなく、GFDのサプリメントとして販売される可能性が最も高いであろう。 代替療法のリスク、利益、およびコストを慎重に比較検討し、そのような新しい治療法がどのような条件および適応症の下で正当化されるかを定義する必要がある[34]。