2021年11月アーカイブ

6.3.2   生来の反応 (先天性((自然))免疫応答)

 

1980年代に、CD毒性ペプチドが、総グリアジン[270,340]およびA-グリアジン[271]の酵素消化物から初めて分離された。それらは、α-グリアジンのN末端配列（α3-55、α3-24、α25-55、α1-30、α31-55）に由来し、器官培養アッセイで有意な毒性効果を示した。その後、ペプチドα31-43、α31-49、およびα44-55の毒性は、点滴試験によりin vivoで確認された[341,342]。ただし、α-グリアジンのN末端配列からの5つの重複ペプチド（1-19、11-28、21-40、31-49）は、唯一HLA-DQ2ヘテロダイマーへの弱いまたは中程度の結合を示し、グリアジン感受性DQ2-制限つきT細胞はこれらのペプチドを認識しない[343]。Maiuri等はこれらのペプチドがCDの先天性反応を誘発する可能性があることを示唆した最初の人だった[344]。

 

 

先天性(自然)免疫応答の役割は、CDの病因にいくつかの方法で関与していると思われるため、現在非常に重要になっている。自然免疫は適応免疫と協力して、炎症性Th1応答を誘導し、IEL（Intraepithelial lymphocyte）の数を増やし、上皮に対する細胞溶解攻撃を促進する[345]。先天性反応は、HLA-DQ2陽性のCD患者に見られるが、HLA-DQ2陽性の非CD対照には見られない。 この特異な先天性反応は、なぜDQ2陽性の一部の人だけがCDを発症するのかを説明するかもしれない。 特定の毒性グルテンペプチドは、適応免疫系によって認識されないが、自然免疫系を刺激する。 これまで、α-グリアジン由来のペプチドのみが自然免疫応答の引き金となる因子として同定されてきた。 ライ麦、大麦、オート麦には、α型に属するタンパク質が欠けている。 したがって、これらの穀物からのペプチドが生得的（自然免疫的）な反応を開始できるかどうかは不明である。

α31-49などのペプチドが先天性（自然免疫的）応答を活性化するという事実は、これらのペプチドの受容体が存在するはずであることを意味する。 AGA（Anti-gliadin antiboy）がペプチドα31-49に結合できる場合の経細胞輸送経路が提案された[285]。 この複合体は、次にトランスフェリン受容体CD71に結合し、これは腸上皮全体で保護された獲得免疫を提供する。 Tjon et al., [38]は、ペプチドα31-49の受容体が腸上皮細胞に存在するという仮説も評価した。しかし、この受容体は、直接的にも、UV架橋またはTG2誘導のアミド交換によっても検出できなかった。結論として、腸細胞に対するグリアジンペプチドの直接的なシグナル伝達効果を実証する堅牢なデータはまだ失われており、いわゆる毒性ペプチドの作用メカニズムを明らかにするためにより多くの作業が必要である[293]。

IEL(Intracepithelial lymphocyte)の増加は、CDの主な機能の1つである。 IELは、固有層のCD4 ⁺グルテン感受性T細胞とは表現型および機能が異なる。それらは、上皮の基底外側の腸上皮細胞の間に存在するT細胞の豊富で不均一な集団を表している[299,346]。それらの主な役割は、腸上皮を損傷する可能性のある望ましくない過度の炎症反応を回避しながら、病原体の侵入と拡散を防ぐことにより免疫保護を促進することである。それらは、細胞溶解機能を発揮して、感染細胞および損傷細胞を排除し、上皮の治癒および修復に寄与する調節機能を発揮する。ただし、CDで見られるような炎症および組織破壊反応にも寄与する。 IELは、αβまたはγδTCR（TCRαβ+またはTCRγδ+）およびナチュラルキラー（NK）細胞を保持する、抗原経験のあるメモリーエフェクターT細胞サブタイプCD8 ⁺で構成される[346]。正常な腸のIEL集団は、TCRαβ+ T細胞とTCRγδ+ T細胞で構成されており、約5：1の比率である。

CDの絨毛萎縮に対するIELの寄与は、いくつかの研究によって示唆されており、次の事実に基づいている[299]：
1. CD8 ⁺ IELは、アクティブCDのIFN-γの主な生産者である。
2. CD8 ⁺ IELは細胞溶解性タンパク質（パーフォリン、グランザイム、FasL）に富んでいる。
3.後者のタンパク質の発現は、上皮アポトーシスの増加と関連している。

上皮浸潤はグルテン摂取と高度に相関しており、したがってCDの最も敏感な組織病理学的マーカーであると考えられている[346]。腸細胞100個あたり20〜25個のIELのカウントが境界線であると推定される正常生検とCD損傷生検の間、30を超える値は「病理学的上皮内リンパ球増加症」を表す。特に絨毛先端における絨毛に沿ったIELの分布も、CDの診断のための敏感な形態学的特徴を表している。 TCRαβ⁺ IELの数は、グルテンフリー食を開始すると正常に戻る。対照的に、TCRγδ⁺ IELの数はその後何年も高いままであり、TCRγδ⁺ IELではなくTCRαβ⁺が絨毛萎縮に関連している可能性があることを示している。 CD患者の上皮においてTCRγδ⁺ IELが果たす正確な役割は、まだ議論されている。 Baghatと同僚は、TCRαβ⁺ IELが腸細胞に有害な影響を与え、TCRγδ⁺ IELによって拮抗されることを提案した[347]。この規制機能は、アクティブCDでは圧倒される可能性がある。 CD患者のTCRγδ⁺ IELサブセットが抗原駆動型であるかどうか、および認識される抗原の正確な性質はまだ解明されてない。ほとんどのIELは、さまざまなNK細胞受容体を発現する。健康な小腸では、IELは主に抑制性CD94 / NKG2A受容体を発現します。対照的に、CDのIELはCD94 / NKG2CやNKG2Dのような高レベルの活性化受容体を発現する[346]。

 

サイトカインIL-15は、グルテン誘発性免疫応答のこの部分の中心的役割を果たすと考えられている。炎症性および抗アポトーシスサイトカインであるIL-15は、CD患者の腸で過剰に産生される。小腸生検の器官培養の使用は、このサイトカインの中和が実際にCD病因カスケードを妨げるかもしれないことを明らかにした[344]。 IL-15は、分子量が約14,000の糖タンパク質であり、多数の細胞タイプと組織で発現し、自然免疫と適応免疫の両方で重要な役割を果たす。特に、T細胞とNK細胞の刺激と増殖を調節する。アクティブCDでは、IL-15は上皮細胞と固有層の両方で産生されますが、適応免疫応答に関与するT細胞とB細胞では産生されない。α31-43や伸長型α31-49などのグルテンペプチドは、腸細胞[348]、マクロファージ[349]、および樹状細胞[350,351]の活性化によりIL-15分泌を直接誘導する。これらのペプチドは、HLA-DQ制限T細胞を刺激せず、CD患者でのみIL-15産生を活性化しますが、健常対照では活性化しない。 IL-15は、Tregs(制御性 T細胞 )の有益な抑制能力を損ない、IL-15の存在下でretinoic acid(ビタミンAの代謝物)は思いがけず腸粘膜でグリアジンに炎症性免疫（IL-12とIL-23）の調整特性を引き起こす。この理由でビタミンAを CDに補充する事が不承認される。

 

IL-15は、IELの増殖と生存を強力に誘導することが知られている。 IL-15の大部分は腸細胞の表面に結合したままで、IEL（Intraepithelial lymphocyte）に提示される。 IL-15はIELを刺激してNKG2D受容体を発現させ、上皮細胞を発現させてNKG2Dの上皮リガンドであるMHCクラスI鎖関連分子A（MICA）を発現させる[353,354]。 NKG2D受容体がMICAに関与すると、IELは上皮細胞を殺し、組織破壊に寄与する。したがって、腸上皮細胞におけるIL-15の発現は、細胞アポトーシス、絨毛萎縮、および腸炎症を伴う[355]。損傷した上皮が選択的バリアとして適切に機能しないため、免疫原性グルテンペプチドが組織にアクセスできるようになることは容易に想像できる。これらの発見は、IL-15の発現がそれ自体で絨毛性萎縮および陰窩過形成を誘発するのに十分であるかどうかという問題を提起する[120]。

 

穀物に存在するATI(Amylase trypsin inhibitor)は、自然免疫系のコアクチベーターであることが示唆されている[162]。小麦の両方とも害虫抵抗性分子であるATI CM3およびO.19は、単球、マクロファージ、および樹状細胞における自然免疫応答の強力な活性化因子として同定された。これらの細胞は高度に保存された膜結合分子のクラスであるToll様受容体（TLR）を発現する。これは、微生物の認識に主要な役割を持ち、したがって防御の第一線で作用する。 ATIはTLR4-MD2-CD14複合体に関与し、成熟マーカーのアップレギュレーションをもたらし、CDおよび非CD患者の細胞およびCD患者の生検で炎症性サイトカインの放出を誘発する。 TLR4(TOLL様受容体の１つ)またはTLR4シグナル伝達が欠損したマウスは、ATIを経口投与すると、腸および全身の免疫反応から保護される。これらの調査結果は、穀物のATIをCDの新規寄与者として定義している。さらに、ATIは、他の腸管および非腸管免疫障害における炎症および免疫反応を促進する可能性がある。

6.4  おわりに

さまざまな免疫学的メカニズムの理解の向上により、CD病因の現実的なスキームの作成が可能になった[356]。 CDの媒介における重要な環境要因は、小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦のグルテンタンパク質である。これらのタンパク質の不完全な胃腸分解により、小腸内腔にCD活性（免疫原性、毒性）グルテンペプチドが出現する。グルタミンとプロリンが豊富なこれらのペプチドは、2つのシグナル免疫応答を誘導し、最初のシグナルは自然免疫によって生成され、2番目のシグナルは適応免疫によって生成される[357]。毒性ペプチドは、IL-15発現の増加、IEL増殖、上皮細胞の炎症、腸透過性の増加を特徴とする先天性免疫応答を引き起こす。適応免疫応答では、免疫原性ペプチドは、透過性の増加とタイトジャンクションの開放により上皮バリアを通過する。粘膜固有層に到達した後、TG2によって脱アミド化または架橋される。これらの修飾ペプチドのAPC（Antigen-presenting cell）上のHLA-DQ2 / 8への結合およびグルテン感受性T細胞への提示は、炎症性Th1応答を活性化する。この応答は、IFN-γやTNF-αなどのさまざまなサイトカイン、および上皮細胞の損傷に寄与する他の免疫学的分子の産生によって特徴付けられる。 自然免疫応答と適応免疫応答の両方が、上皮のアポトーシスと粘膜破壊を引き起こし、CDの腸の炎症の発生に寄与する。 さらに、刺激されたT細胞はB細胞によって抗炎症性Th2応答を活性化する。グルテンに対する抗体およびTG2に対する自己抗体の産生を開始する細胞、適応応答の誘導における遺伝学とグルテンの相互作用は現在よく理解されていないが、先天的応答とIL-15合成の誘導における遺伝学と環境因子、特にグルテンペプチドのそれぞれの寄与を明らかにするためにさらなる研究が必要である[346]。 適応免疫と自然免疫間のクロストーク(漏話)をどのように調整するかは、CDおよびグルテン感受性のさまざまな段階をよりよく理解し、予防戦略を設計し、新しい治療アプローチを開発するために取り組む必要がある顕著な問題である[299]。 CDの自然免疫と適応免疫の正確なメカニズムを解明するために、さらなる研究が期待されるかもしれない。

6.3.1.2  HLA-DQヘテロダイマー

HLA-DQ2および-DQ8対立遺伝子は、CDの原因遺伝子である。 DQ2およびDQ8ヘテロダイマーは、APC（Antigen-presenting cell,成熟樹状細胞、マクロファージ、B細胞）の細胞表面に発現するHLAクラスII分子である。対立遺伝子A1 ∗ 0501、0505、0201、03に対応するα鎖と、対立遺伝子B1 ∗ 0201、0202、0301、0302に対応するβ鎖の完全なアミノ酸配列（シグナル伝達ペプチドなし）は、図1.14である。見てわかるように、α鎖とβ鎖のそれぞれの中の異なるタンパク質は、高度の配列相同性を示している。 DQ2 A1 ∗ 0501および0505のα鎖は、シグナル伝達ペプチドの1つのアミノ酸残基を除いて同一である。

 

結合したα鎖とβ鎖は、「ペプチド溝」で免疫原性グルテンペプチドに結合し、固有層のT細胞に提示する。免疫原性脱アミド化グリアジンペプチドα57-68/ E65（QLQPFPQPELPY）との複合体におけるHLA-DQ2.5の結晶学により、DQ2.5分子のペプチドグルーブ内の結合機能に関する洞察が得られた（A1 ∗ 0501 / B1 ∗ 0201） 。ヘテロダイマーのN末端ドメインが結合して溝を形成する：α鎖からの5ターンのαヘリックスは、溝の側壁を形成するβ鎖からのより長いがねじれたαヘリックスと平行に走る（図1.15）[320]。ペプチドの11残基（L（ロイシン）58〜Y（チロシン）65）が実験電子密度マップではっきりと見えた。ペプチドの主鎖原子と DQ2.5の間に13の水素結合がある。DQ2.5およびペプチド側鎖アミドとDQ2.5間の4つの水素結合ある。後者は、このペプチドの9つのコア残基のうち4つが、アミド水素結合に関与できないプロリン残基（P60、P62、P64、P67）であるため、注目に値する。各主鎖の水素結合相互作用の相対的寄与は、一連のN-メチル化ペプチド類似体を調製することにより研究された[321]。結果は、フェニルアラニンF61およびグルタミンQ63の水素結合が結合に最も重要であるのに対し、グルタミン酸E65およびチロシンY68の水素結合は、全体的な結合親和性への寄与が小さいことを示した。

HLA-DQ2.5と-DQ2.2のペプチド結合特異性は類似しているが、DQ2.2にはp3に追加の結合ポケットがあり、セリン、スレオニン、アスパラギン酸が優先され、プロリンはこの位置で不利になっているようである[322]。さらに、DQ2.2と比較してDQ2.5のはるかに高い病気危険性は、DQ2.5 分子が免疫原性ペプチドにDQ2.2（数時間）よりずっと長い（数日間）結合であると言う事により示される [36]。DQ2.2のフェニルアラニンの位置α22でのDQ2.5のチロシンによる置換（図1.14）により、DQ2.5分子のペプチドカーゴをより長時間保持する能力が明らかに向上する。 HLA-DQ2と同様に、HLA-DQ8のペプチド結合溝は、負に帯電した残基とのペプチドの結合を促進する。機能的結合研究により、グルタミン酸のアンカー( つなぎ止め )位置position 1とposition 9、疎水性残基のposition 4が示唆された（表1.5）。グルテンペプチドQQYPSGEGSFQPSQENPQと複合体を形成したHLA-DQ8の結晶構造により、結合アンカーサイトposition 1およびposition 9で負に帯電した残基が優先されることが確認された。 1つのグルタミン酸残基のみを必要とするDQ2とは対照的に、DQ8への結合には2つのグルタミン酸残基が必要である。この制約は、DQ2陽性患者と比較して、DQ8陽性患者で活性のあるグルテンペプチドの数が少ないことを説明できる。

 

DQ8ヘテロダイマー（A1 ∗ 03 / B1 ∗ 0302）は、DQ2.5ヘテロダイマーと強い構造的類似性を持っている（図1.14）。それでも、バックボーン構造には2つの顕著な違いがある。まず、DQ8の位置α56に2番目のアルギニン残基（R）を挿入すると、この配列領域のαヘリックスストレッチの長さに影響する。第二に、DQ2.5のβ鎖はβ71位に正に帯電したリジン残基（L）を有し、これは免疫原性ペプチドの負に帯電したグルタミン酸の結合に重要である。 DQ8にはβ71にスレオニン（T）が含まれており、この領域には全体的に中性の静電ポテンシャルがある。この違いと一致して、エピトープα57-68/ E65がDQ8分子によって認識されることを示すデータはない[320]。

HLA-DQヘテロダイマーの組成とCDに進むリスクとの相関関係のモデルがTjonと同僚によって提示された[38]。したがって、APC（Antigen-presenting cell）によってT細胞に提示されるグルテンペプチドのレベルは、CDへの展開に重大な影響を及ぼす。まず、HLA-DQ2.5ホモ接合体の個体は、HLA-DQ2.5ヘテロ接合体の個体よりもCD発生のリスクが5倍高い。これは、HLA-DQ2.5ホモ接合体の非常に強力なT細胞応答およびIFN-γ産生と相関するが、ヘテロ接合体の個人ははるかに弱い応答を示す[35]。ホモ接合体とヘテロ接合体のヘテロダイマーは、β鎖の1アミノ酸残基（β135アスパラギン酸/グリシン）だけが異なり（B1 ∗ 0201対B1 ∗ 0202）、この小さな違いが機能的な結果をもたらす可能性は低い[324] 。明らかに、APCの表面に表されるA1 ∗ 0501 / B1 ∗ 0201ヘテロダイマーの数は、T細胞応答の大きさを定義する。HLA-DQ2.5のヘテロ接合体の個体は、ホモ接合体の個体よりもグルテンペプチドを提示できるヘテロダイマーの存在量がはるかに少ない（図1.16）[300]。

 

第二に、HLA-DQ2.5のそれぞれにおけるCD発生の可能性は、HLA-DQ2.2のそれぞれよりもはるかに高い。この違いは、免疫原性ペプチドの結合エピトープの位置position 3のプロリン（図1.17 [325]）がHLA-DQ2.2（A1 ∗ 0201 / B1 ∗ 0202）への結合に悪影響を与えるという事実によって説明される。その結果、HLA-DQ2.5は、HLA-DQ2.2よりもはるかに幅広いグルテンペプチドのレパートリーを提示できるのに優れている。第三に、CDは主にHLA-DQ2.5に関連し、HLA-DQ8にはあまり関連しない。 HLA-DQ2.5制限ペプチド（表1.5）とは対照的に、HLA-DQ8制限ペプチドはプロリンが豊富な領域に由来しない可能性があるため、おそらく胃腸管での分解を受けやすくなる。第四に、ほとんどのCD患者がオート麦に耐性があるという事実は、グルテンの提示レベルが重要なパラメーターであるというさらなる証拠を提供する。アベニン（オート麦タンパク質）には免疫原性エピトープが2つしか含まれていないが（表1.5）、小麦、ライ麦、大麦のグルテンタンパク質には数十のエピトープがある。要約すると、これらのデータは、CDの成りやすさの閾値の存在を示している。 HLA-DQ2.5ホモ接合体のそれぞれの場合、閾値は最も簡単に超えられるが、一方HLA-DQ2.2とHLA-DQ８のそれぞれは閾値がそれよりずっと高い。

 

6.3.1.3 Cellular Response（細胞応答）

 

腸細胞層を通過して固有層に到達したグルテンペプチドは、細胞外TG2の基質として好ましい。脱アミド化とアミド交換が起こる場所と時期は依然として問題である。アミド分解とアミド交換の比率は、約1：3と推定されている[160]。細胞外マトリックスに放出されたTG2は通常、短時間だけ触媒活性を維持し、すぐに酸化により沈黙する。この不活性化に関与するCys 230、Cys 370、およびCys 371は、Cys 370からCys 230または隣接するCys 371のいずれかに結合したジスルフィド結合を形成する[326]。ただし、高いCa^{2 +}レベルと進行中の免疫応答によって引き起こされる還元環境の増加により、TG2を不活性化から保護できる。細胞外TG2の存在に関する別の説明がTjonのグループによって提案された[38]。 HLA-DQ分子に対するネイティブ（脱アミド化されていない）グルテンペプチドの親和性が弱い場合でも、CD4 + T細胞への提示によりIFN-γが生成される。次の軽度の炎症は、TG2放出による組織損傷を引き起こし、脱アミド化による適応免疫応答を強化する可能性がある。

 

固有層に現れる天然および脱アミド化グルテンペプチドは、APC(抗原提示細胞)、主に樹状細胞だけでなくマクロファージおよびB細胞（抗体生成細胞）の表面に発現するHLA-DQ2 / 8分子に選択的に結合する（図1.10のステップ4）。これは、これらの遺伝的に決定されたHLA分子と疾患の発症との間に確立された関連性の説明を提供する。 DQ2およびDQ8ヘテロダイマーは、それらのペプチド溝とグルテンペプチドとを結合して後、粘膜固有層のT細胞に提示する。可変長のグルテンペプチドは、通常9アミノ酸残基（position 1〜position 9）で結合され、1つ以上の追加の残基が隣接し、好ましくは左回りのpoly-P ro IIヘリックス立体配座がある[327]。 HLA-DQ2の溝の主要なアンカーポイントは、位置p1、p4、p6、p7、およびp9にある（図1.17）。前述のように、免疫原性脱アミド化グリアジンペプチドα57-68/ E65（QLQPFPQPELPY）と複合体を形成したHLA-DQ2.5の結晶構造は、2つの分子間に複雑な水素結合ネットワークの存在を示した（図1.15）[320]。ペプチドの脱アミド型（E65）は、非脱アミド型（Q65）と比較して25倍高い親和性を示した。明らかに、HLA-DQ2.5のβ71のリジン残基はposition 4とposition 6/position 7のアンカーポジションの間のユニークなポジテブ静電気的区域を作り，エピトープでネガテブにチャージするグルタミン酸残基との結合はここの位置で起こる事は好ましい。

 

グルテンペプチド（天然、脱アミド化、TG2架橋）をAPC(Antigen- presenting cell)表面のHLA-DQ2 / 8分子のペプチド溝に結合した後、化合物はCD4 ⁺ T細胞に提示される（図1.10のステップ4）。 T細胞は、B細胞の形質細胞および記憶細胞への成熟、細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化など、免疫プロセスにおいて他の白血球を支援する。それらの応答は、病原性であるため、つまり組織損傷を誘発するために特定のしきい値を達成する必要がある。 TCR（T-cell receptor、T細胞受容体）は、T細胞に膜結合したヘテロダイマータンパク質であり、HLA-DQ2 / 8によって提示される抗原を認識する役割を果たす。それらは主にジスルフィド結合したα鎖とβ鎖で構成されているが、少数はγ鎖とδ鎖で構成されている。 TCRは、α鎖とβ鎖によって形成される抗原結合部位の構造によって決定される独自の抗原特異性を持ち、ペプチド/ MHC（(Major histocompatibility complex)複合体；主要組織適合性複合体）との接触によって活性化される。腸組織中で抗原に結合したAPC（Antigen-presenting cell）は、腸間膜リンパ節に移動することができるが、そこでは抗原提示とナイーブ（うぶな）CD4 ⁺ T細胞のプライミング（免疫記憶）が起こる [123]。活性化後、グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は、全身循環の短い通過後に固有層に戻る。組織では、プライムCD4 ⁺ T細胞は、グルテンを消費する患者のグルテンペプチドを提示する局所常駐APCによって再活性化されるか、グルテンフリー食事をしている患者のメモリーT細胞として休眠状態のままである。

 

1993年、Lundinと同僚は、CD患者の小腸生検におけるグルテン感受性T細胞の存在を最初に記述した[328]。それ以来、多くの研究により、このようなT細胞はグルテンに由来する多数のペプチドに特異的であり、患者ごとに異なる可能性のあることが確立された。グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は、in vitro試験後の対照群からではなく、患者の生検標本から容易に分離できる [329]。ただし、これらの抗原特異的細胞を直接視覚化および定量化するための特定の技術が不足しているため、固有層におけるグルテン感受性T細胞の正確な有病率を推定することは困難である。 CD患者の腸生検から直接CD4 ⁺ T細胞をクローニングすることにより、Boddと同僚は、CD4 ⁺ T細胞の0.5〜1.8％がグルテン感受性であることを発見した[330]。これらの細胞の約半分は、免疫原性DQ2.5-グリア-α1aまたはDQ2.5-グリア-α2エピトープのいずれかに特異的だった。フローサイトメトリーで評価すると、10人の未治療CD患者すべてにテトラマー陽性T細胞が存在し、グルテン感受性CD4 ⁺ T細胞は0.1〜1.2％の頻度と調査された。グルテン感受性T細胞は、ほとんどの治療を受けたCD患者でも検出可能であった（7/10）。グルテン感受性T細胞の頻度は、腸粘膜の組織学的損傷の程度とIgA TGAレベルとも相関していた。粘膜固有層におけるT細胞の浸潤は、α/βTCR（T-cell receptor）を持つCD4 ⁺メモリーT細胞（CD45R0 +）によって支配されている。 T細胞認識に必要なペプチドの最小長は9アミノ酸残基である[324]。33-merペプチドなどの複数のHLA-DQ2 / 8結合エピトープを含む大きなペプチドは、単一の結合配列のみを含む小さなペプチドよりも大きなT細胞刺激活性を有す[273]。 TG2によるグルタミンの脱アミド化は、特に子供のCDの初期にT細胞活性化の絶対的な要件ではない[331]。ただし、TG2による脱アミド化は、DQ2 / 8-グルテンペプチド複合体のレベルを高めるだけでなく、in vivoでのグルテン反応性TCRレパートリーの選択にも直接関与する[123]。

グルテン感受性T細胞を活性化するグルテンペプチドの免疫原性エピトープの共通の特徴は、複数のグルタミンおよびプロリン残基の存在である（表1.5）。しかし、修飾ペプチドを用いた数多くの研究により、他のアミノ酸残基も刺激効果に強い影響を与えることが明らかになっている。十分に実証された例は、α-グリアジンの配列領域56〜75であり、65位のグルタミンの脱アミド化後にHLA-DQ2によって提示される最も頻繁に研究されているエピトープの1つである（Qグルタミン65→Eグルタミン酸65）。配列PQPELPYPQPQLPY（α62-75 / E65）は、E65を除く各位置でアラニンによって修飾され、T細胞刺激のテストがされた[332]。結果は、Qグルタミン72、Lロイシン73、Pプロリン74、またはYチロシン75の置換は刺激指数に影響を及ぼさなかったが、他のすべての置換は活性を無効にすることを実証した（図1.18）。 これは、配列PQPELPYPQPの各残基がT細胞刺激に寄与することを示した。 著者らは、Q63、P64、L66、P69、およびP71（アンカー位置position 2、p3、p5、p8、およびp10）はすべてTCRと相互作用する可能性があり、他はDQ2結合の重要な残基であると仮定した（図1.17）。

 

HMW-GS 1Dx2で同定されたHLA-DQ8制限エピトープは、残基723〜735（QQGYYPTSPQQSG）の最小コア領域を持つことが示され（図1.19）、T細胞刺激のための脱アミド化を必要としなかった[333]。グルタミン残基Q724およびQ732は、それぞれDQ8 / TCR複合体内のアンカー位置p1およびp9を占めると予想された。 T細胞刺激に寄与する残基を特定するために、一連の置換類似体をテストした[334]。 p2でのG725、p4でのY727、p5でのP728、およびp8でのP731の置換は、T細胞認識を無効にした。 P728およびP731の重要な役割は、おそらく結合溝内のペプチドの正しい立体構造の維持を反映している。対照的に、置換はp3（Y726）、p6（T729）、およびp7（S730）で受け入れられる。 p1、Q733、またはS734でのQ724の置換はほとんど効果がなかった。アラニン（A）またはアスパラギン（N）によるp9でのQ732の置換は、T細胞刺激を大幅に減少させましたが、リジン（K）またはグルタミン酸（E）などの荷電残基によるQ732の置換は刺激を無効にした。

 

適応免疫系内では、グルテンペプチドによって活性化されたT細胞は2つの異なる反応を誘発する。炎症性Th1反応は上皮を損傷し、抗炎症Th2反応はB細胞を促進して抗体を産生する（それぞれ図1.10のステップ5と6） 。 グルテン感受性T細胞が腸上皮に細胞毒性効果を及ぼす詳細なメカニズムはまだ不明である。 固有層のCD4 ⁺ T細胞は、グルテンペプチドの認識時に活性化され、IFN-γ、IL-4、IL-21、TNF-α、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）などの多くの異なるサイトカインとケモカインを産生する（ステップ5 図1.10）。

 

IFN-γの産生は、粘膜損傷の下流での開始に重要な役割を果たすと考えられている。 IFN-γは二量体化された可溶性サイトカインであり、インターフェロンのタイプIIクラスの唯一のメンバーである。モノマーは、6つのαヘリックスのコアとC末端領域の拡張された折り畳まれていない配列で構成されている。 IFN-γは、ウイルスおよび細菌感染に対する自然免疫および適応免疫に関与し、マクロファージの重要な活性化因子である。多くの自己炎症性疾患および自己免疫疾患は、異常なIFN-γの発現に関連している。 IFN-γとIFN-γの合成を媒介するIL-18は、グルテンペプチドで刺激するとグルテン感受性T細胞によって大量に産生され、上皮透過性の増加に関連している[335]。さらに、IFN-γはHLA-DQ分子のより高い発現を開始し、それによりペプチド提示が増加し、適応免疫応答の自己増幅ループにつながる[38]。 IFN-γの中和は、少なくとも器官培養で維持されたCD粘膜の生検において、グルテン誘発性の粘膜損傷を防ぐことが示されている[336]。

 

IFN-γに加えて、TNF-αおよびMMPは炎症性免疫応答における重要な因子である。 TNF-αは、さまざまな機能を持ち、細胞死（アポトーシス）を引き起こす可能性がある単球由来のサイトカインである。 TNF-αは、それぞれ233アミノ酸残基のホモ三量体複合体を形成し、水素結合により強く安定化されている。 MMPは亜鉛依存性エンドペプチダーゼであり、あらゆる種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解できるが、多くの生物活性分子を処理することもできる。 これらのタンパク質はCDで上方制御され、CD患者の小腸におけるT細胞媒介性損傷の重要なメディエーターであることが示されている[336]。

6.3.1.4   体液性応答

グルテンタンパク質およびTG2に対する血清抗体の存在は、活性CDの特異的マーカーである。 B細胞は、抗炎症性Th2応答内の液性免疫の重要な部分である（図1.10のステップ6）。それらの主な機能は、抗原に対する抗体を産生し、抗原相互作用による活性化後に記憶B細胞に発達することである。抗原に対するほとんどの反応はT細胞に依存しているため、T細胞の助けが必要である。 CDの場合、固有層の抗原提示細胞は、グルテン感受性T細胞にグルテンペプチド（ネイティブまたは脱アミド化）を提示し、それらをプライミングする。 B細胞がプライミングされたヘルパーT細胞に同じ抗原を提示すると、T細胞はサイトカインを放出し、B細胞が増殖してグルテンタンパク質およびペプチドに対するIgAおよびIgG血清抗体を産生する形質細胞に成熟するのを助ける。

B細胞に助けを提供するTG2特異的T細胞はこれまで見つかっていないため、TG2に対する抗体のグルテン依存性産生のメカニズムは完全には理解されていない。 TG2抗体の形成を説明する仮説モデルは、TG2がグルテンペプチドに架橋することができるという事実に基づいて提案されている。TG2抗体の形成は、TG2がそれ自体を架橋して「ハプテン-キャリア様」複合体として機能できるグルテンペプチドにできるという事実に基づいて提案されている（図1.20）[123,300]。このような複合体は、TG2特異的B細胞受容体に取り込まれる。細胞内分解後、グルテンペプチドはエンドソームで放出され、HLA-DQ2 / 8ヘテロダイマーのコンテキストでグルテン感受性T細胞に提示される。これらのT細胞は、B細胞に必要な助けを提供し、B細胞は形質細胞に分化し、TG2特異的自己抗体の分泌を開始する。 TG2特異的抗体を産生する形質細胞は、CD病変で視覚化でき、標識TG2抗原を使用して分離できる[337]。平均して、形質細胞の10％はTG2特異的細胞であり、ほとんどがIgAを産生する。このモデルは、患者を無グルテン食で治療すると、TGAのレベルが低下するという観察結果に適合する。グルテンの非存在下では、グルテン感受性T細胞は刺激されないため、B細胞に助けを提供できず、抗体産生が停止する[338]。さらに、TG2特異的抗体の厳密なHLA依存性の出現の臨床的観察は、このモデルを裏付けている[339]。このモデルはin vivoで正式に実証されていないが、di Niro等は TG2特異的B細胞は、TG2グルテンペプチドコンジュゲートを提供した場合に、グルテン感受性T細胞に実際にグルテンペプチドを提示できるというin vitroでの証拠を提供した[337]。 代替仮説は、粘膜樹状細胞が、胸腺での負の選択を逃れた自己反応性TG2特異的T細胞にTG2を提示する可能性があることである[308]。 これらのTG2特異的T細胞は、TGAの産生のためにTG2特異的B細胞に直接の助けを提供できる。 TG2固有のHLA-DQ2制限付きTの存在の予備的なデモンストレーションは、CD患者の末梢血からの細胞クローンは、この2番目のモデルを確認するようであり、T細胞自己抗原としてのTG2の役割を示唆している。

6.3  免疫応答
進化の過程で病原体と戦うために徐々に構築される人間の免疫システムには、先天性（自然）免疫のメカニズムと適応免疫のメカニズムの両方が関係している。高速自然免疫系は、原始的な多細胞生物の非常に早い時期に発達し、哺乳動物で副次的機能を担うために複雑さを徐々に獲得した：特異性が低く記憶がないにもかかわらず即時の障害に対する役割と、MHC(Major histocompatibility complex,主要組織適合遺伝子複合体分子)分子（299）を介した適応免疫メカニズムに対する抗原提示の２番目の役割がある。遅い適応システムは、脊椎動物でずっと後に出現し、BおよびTリンパ球に依存して、長期記憶を備えた遅延しているが非常に特異的な応答を可能にする。

 

腸関連リンパ組織（GALT）は、免疫系の最大でおそらく最も複雑な部分である[300]。 400m²の表面上で外来抗原の複雑な混合物と連続的に接触している。 GALTは、病原性微生物と食物化合物などの無害な抗原を区別する必要がある。したがって、特定のシグナルが炎症反応を引き起こさない限り、腸管免疫のデフォルト設定（初期設定）は耐性の生成である。腸粘膜に損傷を引き起こすCDの免疫学的メカニズムは複雑であり、多数の免疫担当細胞と免疫学的メディエーター（仲介者）が関与する反応を構成する。 CDの適応免疫応答におけるグルテンペプチドの役割は十分に確立されている。自然免疫応答に関して、いくつかの未解決の問題が存在する。特に、自然免疫と適応免疫のコラボレーションはまだ不明のままである。しかし、適応応答と生得（自然）応答の両方がグルテンを含まない食事で軽減するという事実は、相互依存の可能性を探る方法を示唆している。

6.3.1  適応応答

HLA-DQ2 / 8対立遺伝子がCDの主要な遺伝的危険因子であることが発見されてから[301]、CDの病因において適応免疫応答が中心的な役割を果たすことが説得力をもって確立された。適応免疫は、主な遺伝因子（HLA-DQ2 / 8）と主な環境因子（グルテン）の間に議論の余地のないリンクを提供する。過去数十年間の数多くの研究が、グルテンペプチドに対する適応免疫応答の理解における重要な進歩に貢献した。固有層（基底膜）の免疫カスケードの主要なプレーヤーは、細胞レベルのAPC、T細胞、およびB細胞と、分子レベルのTG2、HLA-DQ2 / 8ヘテロダイマー、T細胞受容体（TCR）、サイトカイン、およびケモカインである（図1.10）。

6.3.1.1  トランスグルタミナーゼ

腸組織に存在するTG（Transglutaminase）は、CDの適応免疫応答に決定的に寄与する。 TG（タンパク質グルタミン-γ-グルタミルトランスフェラーゼ、EC 2.3.2.13）は、グルタミン側鎖（アシルドナー）から一級アミン（アシルアクセプター）へのアシル転移を触媒する酵素である。 TGの最も重要な生理学的機能は、グルタミン残基を含むタンパク質からリジン残基を含む別のタンパク質への共有結合的かつ不可逆的なアミド交換であり、ε-（γ-グルタミル）-リジンイソペプチド結合の形成をもたらす（図1.12（A ））[302]。多くの場合、機械的チャレンジとタンパク質分解に対して非常に耐性のある架橋生成物は、皮膚、髪、表皮の角質化、創傷治癒など、そのような特性が重要な多くの組織に蓄積する。さらに、TGは低分子量第一級アミンのタンパク質への取り込みにより、アミド交換反応を触媒する。特定の条件下で、特にリジンのε-アミノ基または他の一級アミノ基が利用できない場合、または比較的低いpH値では、グルタミンは水との反応によりグルタミン酸に脱アミド化される（図1.12（B））。

TGは、1959年にMycekと同僚によって、インスリンへのアミンの取り込みを触媒するモルモット肝臓の酵素として初めて報告された[303]。その後の多数の調査により、TGはすべての真核生物に遍在し、哺乳類では8つの異なるTG（TG1-7、第VIII因子）が検出されていることが示された。これらの異なるTGはすべて、触媒部位で共通のアミノ酸配列を共有し、類似した遺伝子構造を持っているが、別々の遺伝子によってコードされ、異なる基質特異性と機能を示す。それらの酵素活性はCa^{2 +}依存性であり、グアノシン二リン酸および三リン酸（GDP / GTP）を含む他の因子も哺乳類TGのいくつかの活性に影響を与える。活性化すると、酵素は劇的なコンフォメーション変化を起こす。この変化では、C末端残基が1.2pmほど置換される[304]。

 

一般的に「組織トランスグルタミナーゼ」と呼ばれるTG2は、おそらくTGファミリーの最も遍在的かつ多機能なメンバーである[305]。 Wolfと同僚が開発した高感度のELISAにより、TG2の検出と定量が可能になった[306]。 TG2は、アシルトランスフェラーゼとして作用するほか、Gタンパク質、アダプタータンパク質、細胞表面接着メディエーター、ジスルフィドイソメラーゼ、およびセリン/スレオニンキナーゼとしても作用する[307]。 TG2活性の調節不全は、慢性変性疾患、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、または感染症などのいくつかの病的状態に関連している[308]。 CD患者の抗体の標的とする主要な自己抗原として同定されたため[113]、TG2はCDの病因と診断の調査において重要な役割を果たしてきた。

 

TG2は、687アミノ酸残基の単量体タンパク質で、分子量は約76,000である。 N末端βサンドイッチドメイン（残基1〜139）、α/β触媒コアドメイン（残基140〜460）、および2つのC末端βバレルドメイン（残基461〜それぞれ538および539-687）（図1.13）[305]。システイン（C）277、ヒスチジン（H）335、およびアスパラギン酸（D）358はアシル転移の活性部位を形成し、残基430-453はCa2 +結合部位を形成する。アミド交換またはアミド分解の最初のステップは、タンパク質/ペプチド結合グルタミン残基によるシステイン277の活性部位のアシル化で構成され、アンモニアの遊離とTG2と対応するタンパク質/ペプチド間のチオエステル中間体の形成をもたらす。アミド交換反応では、タンパク質結合リジン残基のε-アミノ基などの求核性一級アミノ基がチオエステル中間体に結合する。脱アミド化反応では、水はグルタミン残基からグルタミン酸残基への転換につながる求核剤である。 おそらく、CDに関与するグルテンペプチドは、ヒスタミンへの一次トランスアミド化を介して脱アミド化される可能性があり、その分泌はCD患者で増加する[309]。 TG2のさらなる特性は、GTP（guanosine triphosphates）に結合して加水分解する能力である。この活性はアシル転移活性とは無関係だが、GTPの結合はアシル転移触媒部位への基質結合を阻害する。

 

もともと、TG2は、通常の生理学的条件下では健康な細胞によって分泌されないサイトゾルでのみ見られる細胞内タンパク質と見なされていた。細胞のストレスまたは損傷のみが、酵素の細胞外マトリックスへの漏出を引き起こす可能性がある。より最近の研究では、TG2は通常の条件下で細胞外空間に分泌され、細胞外マトリックスの安定化とリモデリングに寄与することが示されている[310]。しかし、TG2が分泌されるメカニズムは未だ謎のままであり、「TG2の活性と炎症のどちらが先か？」という疑問が未解決のままである。細胞外環境に分泌されると、高Ca ²⁺および低GTPレベルは、閉じた不活性な立体構造を触媒活性に必要な開いた活性な立体構造に変換することにより、酵素の活性化を促進する。フィブロネクチン、コラーゲン、グルテンペプチドなど、多くのタンパク質およびペプチドが架橋の潜在的な基質である。

 

CDにおけるTG2の可能な役割を説明した最初の研究は、Bruceのグループによって公開された[311]。 対照と比較して、未治療および治療CD患者の空腸組織でTG2活性が増加し、グルタミンに富むグリアジンペプチドがTG2の優先的基質を表すことが示された。 次の多くの調査により、架橋と脱アミド化の両方が起こることが明らかになり、脱アミド化の生理学的重要性はCDとの関連でのみ確立された。 グルタミンは一般に主要なアミノ酸残基であるため、グルテンタンパク質およびペプチドはTG2の好ましい基質（アシル供与体）である。

 

CDの病原性カスケード（流れ、連鎖）では、脱アミド化とアミド交換の両方が重要とみなされる（図1.10のステップ3）。 第一に、TG2はグルテンペプチドの特定のグルタミン残基をdeamidatingが可能で、親和性を高めてHLA-DQ2 / 8分子に結合する修飾エピトープを作成する（以下を参照）。第二に、TG2はグルテンペプチドを、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質やそれ自体を含む他のタンパク質に架橋することができる。そのような架橋は、固有層におけるグルテンペプチドの蓄積を促進する（「ハプテンキャリアモデル」）。さらに、グルテンペプチドとTG2の結合体は、TGA（抗体）の産生を活性化する。適応免疫応答におけるTG2の中心的な役割により、その選択的阻害はCDの代替治療アプローチと見なされている。

グルタミン残基の脱アミド化は、特にHLA-DQ8ヘテロダイマーの場合にはCD4 ⁺ T細胞の刺激が絶対必要ではないが、HLA-DQ2 / 8へのペプチド結合には強く好ましい。 TG2による脱アミド化は、選択されたグルタミン残基にのみ特異的であり、標的グルタミンに隣接するアミノ酸に依存する。グルタミンに対するプロリンおよび疎水性アミノ酸の相対的な位置が重要であることは、合成ペプチドライブラリーによって実証されている[312,313]。配列QXPおよびQXXF（Xは任意のアミノ酸を表し、Q、Pはそれぞれグルタミン、プロリンで、Fは疎水性アミノ酸を表す）はTG2の好ましい基質として同定されているが、QPおよびQXXP配列では酵素は活性ではない。したがって、TG2による脱アミド化は、グルテンペプチドへの負の電荷の非常に選択的な導入をもたらす。これらの発見に基づいて、TG2認識アルゴリズム（手順）が設計され、特権TG2認識配列のさまざまな穀物タンパク質のデータベースをスクリーニングし、多くの脱アミド化感受性エピトープが小麦グリアジンとグルテニン、ライムギセカリン、大麦ホルデイン、オート麦アベニンで同定された。 TG2によって部分的に脱アミド化されたグルテンペプチドエピトープの例を表1.5に示した。

HLA-DQ分子によって制限されるグルテン感受性T細胞エピトープの包括的な新しい命名法がSollidと同僚によって提案された[314]。例は表1.5に含まれている。命名法は、次の3つの基準に基づいている。

１.エピトープに対する反応性は、少なくともある特異的T-細胞クローンによるものであること。

2.取り込まれるHLA-制限要因は不明確に定義されている必要がある。

3.エピトープの9アミノ酸コアは、短縮型ペプチドを用いた分析および/またはエピトープのリジンスキャンを用いたHLA結合または同等のやり方のいずれかによって定義されている必要がある。

 

専用のウェブサイト（http://www.isscd.net/EpitopeNomenclature.htm）は、より多くのエピトープが特定されたとそのリストを更新した。ただし、F-S（LMW-GS）、Y-Y（HMW-GS）、およびF-Q（α-グリアジン）間のペプチド結合など、消化管ペプチダーゼによるこのようなエピトープの切断は、これらの基準では考慮されない。たとえば、Juhazzらは、プロテオームベースのデータセット、CD関連エピトープのコレクション、およびin silico酵素消化により、小麦「Butte-86」のグルテンタンパク質のCDエピトープの数がネイティブの549から消化物中のタンパク質を99まで[315]減少したことを示した。

アミド分解のほかに、TG2はグルテンペプチドとそれ自体の間の架橋を触媒し、HMWコンジュゲートを形成する。共焦点顕微鏡による分析により、TG2は活性CDの上皮および上皮下レベルでグリアジンと共局在し、グリアジンは十二指腸粘膜のTG2に直接結合していることが示された[316]。

TG2とQLQPFPQPQLPY配列を持つ免疫原性グルテンペプチド（α57-68）の複合体の最初の化学的特性は、2004年にFleckensteinと同僚によって報告された[317]。 2種類の共有結合したコンジュゲートが検出された。ペプチドは（1）チオエステル結合を介してTG2の活性部位システインに、（2）イソペプチド結合を介してTG2の特定のリジン残基に結合した。理論的には、TG2はイソペプチド結合形成のために33リジン残基（K）とペプチドα57-684グルタミン残基（Q）を提供する。ペプチド配列内のQ65のみがイソペプチド結合に関与していることがわかった。 TG2内のリジン残基（K）の役割は、TG2とペプチドのモル比に依存することが示された。TG2 /ペプチド比1：1の比率で関与したのはK590のみであり、K562、K590、およびK600は1:10の比率で、K444、K562、K590、K600、K649、およびK677は1:50と 1：100で関与した。イソペプチド結合形成に関与するリジン残基はランダムに分布してはいなかった。 6残基中5残基は、触媒部位から遠く離れたC末端セクションIV（図1.13）にあった。 TG2とグルテンペプチド間のイソペプチド結合の形成は強く方向付けられていると結論付けることができる。

 

さまざまなグリアジンに対するTG2の触媒活性は、Dieterichらによって研究された [318]。 11個のα-、6個のγ-、3個のω1,2-グリアジン、および1個のω5-グリアジンをモノダンシルカダベリン（蛍光アシルアクセプター）およびTG2とともにインキュベートし、続いて増強された蛍光強度を測定した。結果は、テストされたすべてのグリアジンがTG2の良好な基質であることを示した。対照基質であるウシ血清アルブミンおよびラクトアルブミンでは、モノダンシルカダベリンの取り込みは検出されなかった。蛍光TG2活性アッセイを使用して、グリアジンペプチドα2（56-68）の反応性グルタミン（Q）としてのQ65の絶対要件は、TG2 /ペプチドコンジュゲートの形成によって確認された。これらのコンジュゲートのCD特異的関連性は、これらの架橋ネオエピトープに対する自己抗体の産生に由来する（以下を参照）。さらにTG2は、免疫原性グルテンペプチドが、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質に結合することを触媒する。このハプテン化とグルテンペプチドの長期固定化は、CDの腸炎の永続化に重要となる可能性がある[318]。

 

Dorumと同僚による研究の目的は、非常に不均一なタンパク質複合体、すなわち小麦グルテン中のTG2の好ましいペプチド基質を特定することであった[319]。グルテンをペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびカルボキシペプチダーゼで消化した後、TG2および一次アミノマーカー5-ビオチンアミドフェニルアミンとともにインキュベートした。ペプチド/アミン複合体には、ストレプトアビジンDynabeadsを加え、質量分析により同定した。 TG2の好ましい基質として、合計31の異なるグルテンペプチドが見つかった。驚くべきことに、これらのペプチドの大部分は既知のグルテンT細胞エピトープを含んでいた。 33-merペプチドは、同定されたTG2基質には含まれなかった。同じ研究では、4つのα-グリアジンペプチドと1つのγ-グリアジンペプチドが、アミド交換されたグルタミン残基と脱アミド化されたグルタミン残基の両方を持っていることが示された。たとえば、ペプチドα3-24はQ16で脱アミド化され、Q21でトランスアミド化された。

CDにおけるTG2の病原性の役割の理解における大きな進歩にもかかわらず、いくつかの問題が解明されていない[308]。これらには、TG2の細胞内調節、その外在化のメカニズム、TG2によるグルテン修飾の主要部位としての腸細胞の役割、TGA（Anti-transglutaminase antibody）の触媒活性への影響、および脱アミド化および架橋酵素と自己抗原としての2つの異なる免疫関連の関係が含まれる。