3. セリアック病毒性
3.1 毒性のテスト
さまざまな穀物および非穀物原料、穀物タンパク質およびペプチドのCD毒性と免疫原性を特定し、新しい治療法をテストするために、多数のin vivoおよびin vitroの方法が開発された。テストは、（1）CD患者の生体内チャレンジ（2）CD患者の組織および細胞を用いたin vitroテスト（3）動物モデルに分類できる。テストの前に、材料は化学分析によって十分に特性評価される必要がある。
3.1.1 テストする材料
穀物由来のタンパク質およびペプチド製剤は、信頼性の高いステートメントを保証するために、毒性と免疫原性をテストする前に化学的に特性評価する必要がある。小麦グルテンなどの原材料は、たとえばケルダール法またはデュマ法などを使用して、窒素の含有量を分析する必要がある。窒素の含有量は、係数5.7によって粗タンパク質含有量に変換できる。グルテン組成は調製または加工の異なる起源と条件によりかなり変化する可能性があるため、プロラミンとグルテリンの割合や不純物の含有量などのタンパク質組成のさらなる研究が望ましい。たとえば、抽出/液体クロマトグラフィーを組み合わせた手順は、さまざまなタンパク質画分の詳細な分析に使用できる。 in vitro試験の場合、タンパク質はペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチンなどの酵素によって部分的に加水分解され、消化管消化を模倣し、不溶性タンパク質を可溶性ペプチドに変換する必要がある。塩が存在する場合（例えば、酵素消化中の中和ステップから生じる）、乾燥加水分解物のタンパク質/ペプチド含有量は窒素測定により分析する必要がある。少量の精製タンパク質およびペプチドは、RP-HPLCで定量できる。キャリブレーションには、定義済みのリファレンス（PWG-gliadinなど）を使用する必要がある。分離または合成されたペプチドは、純度と同一性を確認する必要がある。この目的には、RP-HPLCと質量分析が推奨される。
3.1.2 生体内試験

ほとんどの研究者は、in vivo試験がCD毒性を評価するためのゴールドスタンダードであることに同意する。これは、数年間GFDを使用しているセリアックボランティアで実施されるため、小腸の形態が正常であることが期待される。最初に、CD患者は、摂食試験に続いてキシロースと脂肪の吸収不良を測定するか、脂肪便などの症状を監視することにより、穀物製品と粗タンパク質画分に挑戦した。ただし、これらのテストは、チャレンジ素材の量とチャレンジの期間最適の不確実性のために不十分であると見なされている。
さらに、キシロース吸収不良および脂肪バランスへの影響は二次的であり、上皮表面での反応に関する情報を提供しない。ほとんどの研究では、わずかなCD患者のみが検査され、対照は含まれていなかった。 1970年代に、腸の生検の技術が導入され、患者とコントロールのより大きなコホート（観察対象集団）が挑戦され、毒性に関するより正確な結論に至った。オートムギ毒性に関するJanatuinenと研究者のin vivo研究は、試験成績の例かもしれない。彼らは、定義された量のオートムギを含む選択された食事で挑戦されたCD患者について無作為化された研究を行った。評価の主な方法は、特別な食事の適用前および血清学的検査を伴う検査後の十二指腸生検による内視鏡検査であった。患者（n = 92）は、オートミールを食べるグループとコントロールグループに分けられた。オートムギグループの患者は、6ケ月または12ケ月間、1日あたり約50 gのオートムギを摂取した。完了すると、その後の組織学的および形態計測的測定と血清学的検査を伴う十二指腸生検が行われた。

このような広範なテストは、大量に入手可能な材料（穀物、小麦粉、小麦グルテンなど）でのみ実行できるが、調製が困難な精製タンパク質やペプチドでは実行できない。寛解期（治療中）のCD患者の小腸への直接注入による経口チャレンジの導入、それに続く試験の開始時および数時間後の生検により、タンパク質およびペプチドの量を約1 gにさらに少なく減らすことができた。例として、グリアジンペプチドα56-75を使用した生体内試験は、次のプロセスで説明されている：Quinton®油圧式、複数生検カプセルにカニューレ（チューブ）を取り付けた。カプセルは、蛍光透視下で鎮静されたCD患者の十二指腸遠位に配置された。消化性トリプシンタンパク質消化物またはグルテンペプチドの溶液は、シリンジドライバーによって2時間十二指腸に注入される。注入前および注入開始の2、4、6時間後に生検を行う。その後、組織をカプセルから取り出し、形態計測分析のためにホルマリンで固定する。組織の一部は部分的に染色され、一部は瞬間凍結される。染色切片の絨毛の高さ、陰窩の深さ、および腸細胞の高さを測定する。凍結切片を使用して、特殊な抗体検査により腸細胞100個あたりの上皮内リンパ球（IEL）の数を測定する。絨毛の高さ、絨毛の高さと陰窩の深さの比率、およびIELの数の変化は、毒性評価の信頼できるパラメーターであると考えられている。
侵襲的（生体を傷つける）な生検検査を避けるために、CD毒性の可能性のある薬剤による経口投与後の腸透過性の測定または末梢血T細胞の検査を使用して検査することができる。透過性試験は、血液循環に対する腸の障壁を特異的に通過するオリゴ糖（ラクツロースなど）と単糖（マンニトールなど）の経口投与に基づいている。小さい分子（単糖）はバリア機能の喪失とは無関係に、腸のバリアを自由に通過することを考えたのに対し、より大きな分子（オリゴ糖）はバリア機能の喪失中にのみ通過する。経口摂取後5〜6時間に収集された尿サンプル中の両方の糖類の比率は、バリア機能の損失、したがって、テストされた薬剤のCD毒性を反映すると考えられる。ただし、14日間、3.0または7.5 gグルテン/日にチャレンジしたGFDで20人のCD患者を用いたin vivo試験では、ラクツロースとマンニトールの比率に有意な変化は見られなかったが、生検形態、抗体価、および胃腸症状大多数の患者で変化した。したがって、糖とタンパク質/ペプチドに対する異常な腸管透過性の間の相関の程度は確立されていない。
血液検査に関して、CDが確認された患者は、検査対象の薬剤で3日間の経口チャレンジを受ける。末梢血単核細胞（PBMC）は数日後に分離され、薬剤（ペプチドまたはタンパク質）とインキュベートされる。インターフェロン-γ（IFN-γ）応答は、サイトカイン特異的アッセイにより測定される。直腸は粘膜組織を取得するためのアクセスが容易な部位を提供するため、局所グルテン攻撃に対する反応が調査された。 2 gのグルテン消化物で攻撃されたCD患者の直腸粘膜は、粘膜固有層の著しい腫脹、マスト細胞の急速な低下、IELの顕著な上昇、および粘膜固有層のリンパ球の実質的な浸潤を示した。これらの観察は、直腸粘膜がグルテンに感作されていることを示しており、したがって、調査および診断の目的に便利なアプローチを提供した。
3.1.3 生体外試験

毒性を試験するためのin vitroシステムの開発は、少量（≈1mg以下）を試験できるため、純粋なタンパク質およびペプチドの研究における重要なステップである。 CD患者の腸組織の器官培養は、最も信頼性の高いin vitroモデルであることが提案されており、in vivo状況を反映している可能性がある。このテストは、1969年にBrowning and Trierによって最初に導入された。 CD患者の組織は、診断手順の一部として採取され、テスト対象のタンパク質またはペプチドを含む培地でインキュベートされる。長期培養後の粘膜形態の質の保証はないが、生検は培養システム内で24〜48時間またはそれ以上継続することができる。元々、活動的なCD患者の生検が行われ、組織は培養液のみで酵素活性、炎症の徴候、および形態の改善を示したが、CD毒性物質の存在下では認められなかった。現在、寛解期の患者の組織は潜在的に有毒な物質とインキュベートされ、サイトカイン（例：IFN-γ、インターロイキン（IL）-4、IL-10）および一酸化窒素などのCD特異的効果のマーカーが測定される。この方法の利点の1つは、治療を受けた患者の生検でCDに特徴的なさまざまな特徴を再現できるため、研究者がCDの開発に関係するメカニズムを発見できることである。腸生検には腸細胞と粘膜固有層が含まれているため、このモデルは生得応答と適応応答の両方を判断するのに役立つ。欠点は、器官培養システムがハイスループットな方法ではなく、組織に循環、神経系、およびリンパ器官への接続がないことだ。器官培養システムは、毒性効果を検出するための最良のin vitroモデルだが、免疫原性効果のみを特定するT細胞に関する研究に広く置き換えられている。1990年代から、小腸粘膜またはCD患者の末梢血からのT細胞株およびクローンが、タンパク質およびペプチドの免疫原性効果を測定し、潜在的な新規治療形態をテストするために使用されてきた。グルテンに対して産生されたT細胞株とクローンは、多数の実験を行うのに役立ち、刺激に対するT細胞の反応を容易に実証する。グルテン感受性T細胞は、in vitroで培養および刺激された腸の生検から分離でき、または3日間の経口グルテンチャレンジ後6日目に治療を受けたCD患者の血液に見られる。頻繁に使用されるテストは、抗原提示細胞（APCs）（例えばB細胞）およびトリチウム化チミジンの存在下でTG2で処理された推定抗原（約100〜200μg/ ml）と腸のCD感受性T細胞のインキュベーションによって実行されるT細胞増殖アッセイである。シンチレーション測定によって決定されたT細胞の増殖は、免疫原性効果のパラメーターである。さらに、IFN-γまたはILの産生を測定できる。 T細胞検査は、免疫原性効果のレベルを比較するために広く使用されている。たとえば、異なるグリアジンペプチドおよびオートムギ栽培品種とのインキュベーション後、刺激指数（抗原の1分あたりのカウントを抗原なしの1分あたりのカウントで割った値）およびIFN-γ濃度を測定するために増殖アッセイを適用した。 T細胞の感度は大きく変化し、刺激を受けた患者と刺激の手順に依存するため、参照グルテンタンパク質またはペプチドを比較のために摂取する場合、相対的な値のみを決定できる。グルテン感受性クローンからではなく、複数のCD患者からのグルテン感受性T細胞株の使用が推奨されている。
グルテンに敏感なT細胞は腸組織ではまれなので、直接評価することはできない。十分に高い頻度で新鮮なポリクローナルグルテン感受性T細胞の唯一の既知のソースは、短期経口グルテンチャレンジの直後に採取されたCDドナーからの末梢血である。グルテン攻撃の数日後に収集されたCD患者の末梢血単核細胞は、96ウェルプレートを使用して潜在的な抗原とインキュベートされる。 IFN-γの放出は自動リーダーによってカウントされ、グルテンタンパク質の免疫原性T細胞エピトープの包括的なマッピングが可能になる。一般に、T細胞は腸内に存在する他の細胞タイプとの関連性がないため、in vivoで小腸を必ずしも反映しないことに言及する必要がある。さらに、T細胞は抗原に対する反応が異なることが多いため、異なる患者の複数のT細胞株を同時に適用する必要がある。さらに、免疫原性は、in vivoまたは器官培養試験で示される毒性に常に対応するとは限らない。例えば、オートムギのプロラミン画分であるアベニンは、T細胞試験では免疫原性を示すが、器官培養試験では非毒性であることが示された。
皮膚試験、ヒトK562（S）細胞による凝集試験、白血球遊走阻害試験、またはマクロファージ凝血促進活性試験などの難易度の低いスクリーニングアッセイは、一般に受け入れられていない。 1990年代以来、2つの上皮細胞培養モデル、T84細胞とCaco-2細胞が、CD特有の効果をテストするためのモデルとして使用されてきた。
T84細胞は結腸癌の肺転移に由来する。この細胞株は、結腸起源だが、高分子およびイオンに対する腸上皮透過性の研究に広く使用されている。 T84細胞は、CDの病因の研究、例えば、自然免疫反応および腸管透過性への影響の研究にも応用されている。 Caco-2細胞は、比較的高分化したヒト結腸腺癌に由来する。コンフルエンスに達すると、細胞は自発的に分化し、先端表面が微絨毛で覆われた分化した腸細胞の超微細構造形態を保持する。 Caco-2細胞は、タイトジャンクションと、腸の内側の細胞に特徴的な多くの酵素とトランスポーター（通路膜タンパク質）を含んでいる。これらの特性により、Caco-2細胞は腸上皮バリアのモデルとして、およびCDに関連する研究で広く使用されている。例えば、それらは個々のペプチドがどのように処理されるか、CD患者の抗体が疾患の病因にどのように関与するかを明らかにするために使用されてきた。
3.1.4  動物モデル
ヒトの腸内物質とは別に、グリアジン画分の細胞毒性活性を実証するために、ラットまたはヒヨコ胎児の未熟腸の培養物が使用されている。 CD活性化合物は、非常に未熟な小腸の発生と形態形成を阻害し、グリアジンペプチドがその形態形成の初期段階で小腸粘膜に対して直接的な損傷活性を有する可能性があることを示す。別のアプローチは、活性グリアジンペプチドによって引き起こされるラット肝臓リソソームの破壊を研究することである。
CDの免疫学的経路とメカニズムをよりよく理解するために、さまざまな目的の動物モデルを作成するために多くの試みが行われた。現在、グルテン依存性下痢を自発的に生成する3つのモデルがある：（1）犬、（2）アカゲザル、および（3）馬モデル。犬モデルでは、アイリッシュセッターはグルテンの消費に応じて部分的な絨毛萎縮とIEL浸潤を発症する。アカゲザルではグルテン依存性の小腸粘膜損傷が報告されており、炎症性小腸疾患のウマではグルテン依存性の抗体レベルの上昇が観察されている。これら3つの自発的モデルすべてに共通するのは、HLA-DQ2 / 8対立遺伝子との関連性の欠如である。他のモデル（マウス、ラット、ウサギなど）は自発的ではなく、グルテン感作、化学的および/または薬物治療、およびCDの機能を開発するための遺伝子改変が必要である。マウスモデルは、特定の遺伝子のCDの発生への寄与を評価するために導入遺伝子を導入できるため、他のモデルよりも大きな利点がある。例えば、ヒトHLA-DQ2または-DQ8を発現するトランスジェニックマウスが生成されたが、使用された動物のいずれも本格的な絨毛萎縮を発症しなかった。デ・パオロと共同研究者は、グリアジンを与えられたヒト化HLA-DQ8マウスが固有層でIL-15を過剰発現していることを報告した。ただし、粘膜構造は正常のままであった。多くの研究でトランスジェニックマウスを使用して、CD病因のさまざまな要素（CD4 + T細胞、TG2、IL-15、腸内微生物叢の役割など）を調査した。特定のマウスモデルは、CDの新規治療法のテストにも使用された。病原性ステップを標的とする例は、グルテンペプチドの修飾、自然反応の抑制、ゾヌリン-1、炎症性T細胞応答の抑制、およびIL-15またはIL-15の受容体の遮断である。これらすべての試みに関係なく、この障害のすべての側面を再現するCDの動物モデルはまだ開発を待っている。
3.1.5 毒性レベル
多くの出版されたものが、穀物、タンパク質画分とタイプ、およびペプチドのCD毒性レベルに関する推測を提供している。たとえば、六倍体の普通小麦は、最も毒性の強い穀物として頻繁に説明されている。二倍体および四倍体の小麦種は、六倍体の普通小麦よりも毒性が低いことが示唆された。

グリアジンはグルテニンよりも毒性が強い傾向がある。グリアジン内では、α-グリアジンが最も毒性が強く、γ-グリアジンとω-グリアジンの毒性の低いことが提案された。 DホルデインとCホルデインはホルデインの中で最も免疫原性が高いことがわかった。多数の報告が、α2-グリアジンからの33量体ペプチドがグルテンペプチド内の最も重要な免疫原性物質であることを強調している。これらの仮定はすべて正当化されているのか、CDの毒性と免疫原性のレベルを決定することはまったく可能なのか？

意欲的な患者の数が限られていること、毒性効果を生み出すのに必要な薬剤の量が比較的多いこと、実験の労力が大きいため、毒性レベルの統計的に有意な評価のために生体内チャレンジを考慮することはできない。対照的に、CD患者に由来する小腸生検の臓器培養は、毒性効果の違いを測定する可能性を提供する。寛解期の患者の組織は潜在的に有毒な物質とインキュベートされ、酵素活性、形態的特徴、サイトカイン濃度などのCD特異的効果のマーカーを測定できる。陽性および陰性の対照物質を実験に含める必要がある。例として、ペプチドα31-49と10人のCD患者の検体で試験した5つのアラニン置換変異体の検査を示した。フレイザーの画分FIII（小麦グルテンの消化性トリプシン消化物の水溶性部分）およびオボアルブミンをそれぞれ陽性および陰性コントロールとして使用し、培地のみと比較した腸細胞の高さの変化を毒性のマーカーとして使用した。結果は、非修飾ペプチドα31-49は、陽性対照と同程度の毒性があった。ペプチドα31-49 / A31およびα31-49 / A36は毒性が低かった。また、ペプチドα31-49 / A38、α31-49 / A39、およびα31-49 / A42は非毒性だった。器官培養システムが多種多様な細胞タイプを含み、生体内の状況を反映していることを考えると、この方法が少数の研究でのみ使用されていることは驚くべきことである。
対照的に、CD患者の小腸粘膜および末梢血から得られたグルテン感受性T細胞による検査は、CD特異的免疫原性効果の評価に広く使用されている。T細胞株とクローンの感度と特異性は、いくつかのパラメーター（例えば、それらが採取された患者や刺激に使用される薬剤）に強く依存している。一部のT細胞は特定のグルテンペプチドに高度に特異的であるが、他のT細胞は相同ペプチドと交差反応し、これらのT細胞間の比率は患者ごとに異なる。これらの制限を克服するために、T細胞クローンではなく、異なる患者からの複数の同時T細胞株の適用が推奨されている。