3.2 穀物の毒性

1950年にディッケの論文で始まった初期の調査では、小麦、ライムギ、大麦はCD患者に有害であるが、米とトウモロコシは有害ではなかったことが示された。ソバやジャガイモなどのイネ科以外の植物は安全であると見なされていた。当時は腸の生検の技術が利用できなかったため、研究は摂食試験とその後の症状と脂肪またはキシロースの吸収不良の出現に依存していた。その後、腸の生検と免疫原性反応に関する組織学的研究が毒性判断に使用された。オートムギの毒性についてはまだ意見の相違はあるものの、小麦とオートムギだけが広く研究されており、小麦の疑いのない毒性をもたらしている。ライムギと大麦のテストはかなり最小限だったが、貯蔵タンパク質の構造から推測される小麦との強い類似性は、CDの毒性を裏付けている。トウモロコシ、イネ、モロコシ、キビ、およびすべての非穀物植物が安全であると見なされるようになった。これは、おそらくこれらの作物を含む食事からの矛盾する証拠が何十年も遭遇していないからである。小麦を含まないモロコシ食品の安全性は、in vitroおよびin vivo試験、ならびにゲノム、生化学、および免疫化学分析によって確認された。
Kasardaによると、植物の分類法は、植物を安全または危険として分類するのに役立つガイダンスを提供するかもしれない。間違いなく有毒な穀物（小麦、ライムギ、大麦）はすべて、草の科（Family）内の単一の族(Tribe)、Triticeaeで見つかる。この植物関係および類似のタンパク質パターンにより、CD患者はすべての小麦種、ライコムギ、およびライムギとオオムギのすべての植物形態を避ける必要がある。毒性に関して議論の余地があると判断されたオートムギは、同じ亜科（Subfamily） Pooideaeに属しているが、別の族(Tribe) Aveneaeに属している。すべての非毒性の一般的な穀物（イネ、トウモロコシ、ソルガム、ヒエ）およびほとんど使用されない穀物（テフ®、ラギ、ヨブの涙）は、コムギ科からより離れており、草の科（Family）内で別々の進化系統を示す。ソバ、アマランス、キノアなどの草科(Family)以外の種子は安全であると想定されている。
四倍体（デュラム、エンマー）および二倍体（インコーン）小麦種は、Dゲノムが存在しないため、六倍体（一般的、スペルト）小麦よりもCD患者に有毒なタンパク質エピトープが少ないことが提案された[83]。実際、グルテンタンパク質の成分は少ない。しかし、小麦粉中のタンパク質量はさらに多く、すべてのグルテンタンパク質タイプが存在する。さらに、α-グリアジンのN末端配列決定は、異なる小麦種の間で高度の一致を示した。それにもかかわらず、刺激性エピトープのレベルに違いが存在する可能性がある。Molbergと共同研究者は、免疫原性33-merペプチドと同一または同等のタンパク質断片が小麦染色体6D上のα-グリアジン遺伝子によってコードされているため、二倍体インコーン（ゲノムAA）および四倍体デュラム小麦（ゲノムAABB）のグルテンが存在しない事を見出した。 Triticum monococcumグリアジンの毒性の欠如は、in vitro organ culture system でも又示された。

しかし、グルテン感受性T細胞および器官培養試験に基づく他の発見は、古代小麦種のCD毒性の証拠を提供した。
オートムギをGFDに組み込むと、高繊維、ビタミンB、マグネシウム、亜鉛、鉄の含有量、嗜好性の向上、心血管の健康に対する有益な効果が得られる可能性がある。ただし、CD患者の食事からオートムギを除外する必要性については議論の余地がある。 Sontag-StrohmおよびPawloskaのグループは、チャレンジした個体数、毎日与えられたオートムギの量、チャレンジの期間、および臨床測定を含む毒性試験の概要を提示した。 1953〜1976年のオートムギに関する報告は、オートムギin vivoチャレンジ後の異なる効果を明らかにした。効果は、吸収不良試験で示されるように有害であるか、腸生検で示されるように無害であった。ただし、これらの研究は少数の患者に基づいており、チャレンジ期間は短かったため、オートムギのサンプルは小麦、ライムギ、または大麦の混入についてテストされていなかった。その後の研究はより包括的であり、より多くの患者が純粋であることが証明されたオートムギに挑戦された。最大92人のCD患者とコントロールを含むさまざまなコホートに、3〜60か月間の1日あたり10〜93 gのオートムギがチャレンジされた。使用された検査と測定の種類は、主に組織学的判断と血清学的検査を伴う十二指腸生検だった。結果は、オートムギは臨床的に許容され、組織学的損傷も細胞性または体液性免疫応答の誘発も引き起こさないことを明らかにした。それぞれ1〜5年にわたる長期の研究でさえ、患者が有害な影響なしにオートムギに耐えることを実証した。別の研究では、CDを患う子供はGFDで2年間にわたってオートムギに耐性があり、その間定期的に監視されていたと述べている。同様の発見は、もう一つのグルテン関連障害である疱疹状皮膚炎の患者でも行われた。しかし、2つの研究は、少数の患者に対するオートムギの有害な影響を示した。オートムギに敏感なケースの数が限られているため、このサブグループのサイズの数字による推定値は入手できない。最も可能性が高いのは、このサブグループがCD患者の1％未満を構成している可能性があることだ。主に良好な臨床的証拠にもかかわらず、オートムギがGFDに含まれることは継続的に議論されてきた。オートムギのプロラミン画分であるアベニンの含有量が比較的低いことは、ほとんどの患者にとって明らかな安全性を説明していると主張された。その後、オートムギ粉から分離された純粋なアベニンによる試験が実施された。繰り返すが、明確な結果は得られなかった。たとえば、T細胞試験では、小麦（グリアジン）、ライムギ（セサリン）、および大麦（ホルデイン）のプロラミン画分に相当する免疫応答が示されたが、器官培養試験は陰性だった。
結論として、臨床研究では、CD患者に対するオートムギの一般的な無害性を支持する限られた結果しか得られない。オートムギを継続的に摂取する人（子供には20〜25g /日、大人には50〜70g /日）が適切な臨床フォローアップ必要であることが推奨されている。
さらに、オートムギ製品は、小麦、ライムギ、または大麦の汚染についてテストする必要がある。これは、市販のオートムギの供給がこれらの穀物でひどく汚染されている可能性があるためである。いくつかの研究グループは現在、CDに毒性のないオートムギ品種の選択の基礎として、オートムギの潜在的な免疫原性の多様性を研究している。オートムギ品種間の2つの既知の免疫原性アベニンエピトープの違いは、すべてのCD患者にとって完全に安全なオートムギ品種の選択と育種が現実的な可能性があることを示している。 CD患者から分離されたT細胞に関する研究は、オートムギ品種は、非免疫原性、中程度の免疫原性、または高度な免疫原性のいずれかで、異なる免疫原性を持つ可能性があることを示した。免疫原性の程度は、特定のグルタミンおよびプロリンが豊富なペプチドの存在に関連していた。しかし、13の2倍体、4倍体、および6倍体オートムギ種のアベニン遺伝子の評価により、すべてが2つのCD特異的アベニンエピトープを含むことが明らかになった。著者らは、これらのエピトープを欠くエンバク品種が見つかる可能性は非常に低いと結論付けた。

3.3 タンパク質画分の毒性

初期の調査により、小麦、ライ麦、大麦、そして場合によってはオート麦はCD患者に有害であるが、トウモロコシ、米、ソルガム、およびキビは無害であると考えられているという結論に至った。有毒穀物の中では、最初から小麦タンパク質に、そしてその後オートムギタンパク質に調査が集中した。初期の研究者は、脂肪便などの症状の発生とキシロースまたは脂肪の吸収不良の測定に基づいた摂食試験を使用して毒性を確立した。 Dickeのグループの先駆的な研究により、水溶性画分（アルブミン）ではなく、小麦粉生地のゴム様タンパク質画分であるグルテンが毒性因子を負った。小麦グルテンの分別により、アルコール可溶性グリアジン分画が最も毒性の高い因子であるという結論に至ったが、不溶性グルテニン分画の効果は、グリアジン分画と同様に、非毒性、弱毒性、または毒性のいずれかとして議論された。グルテニン画分は一般に、鎖間ジスルフィド結合を介してグルテニン凝集体に共有結合している奇数のシステインを有する修飾ω-、α-、およびγ-グリアジンによって汚染されていることに言及する必要がある。したがって、グルテニンの毒性に関する記述は、グルテニン画分全体に関する研究ではなく、精製されたグルテニンサブユニットに基づいてするべきである。
グリアジン画分または小麦グルテンのいずれかを使用して、さらに基本的な研究を実施した。重要な結果には以下が含まれる：グリアジンの加熱と酸化によるジスルフィド結合の切断は毒性を減少させなかった。結果として、グリアジンの三次元構造は、その毒性効果にとって重要ではない。対照的に、酸加水分解によるグリアジンのアミノ酸への完全な分解は、それらを無害にした。

グルタミン、最も頻繁に貯蔵タンパク質中にあるアミノ酸であるが

CD患者に許容される。ペプチド結合の限られた切断を伴う希釈塩酸によるグルタミン側鎖のグルタミン酸側鎖への広範な脱アミド化は、グリアジンの解毒を引き起こし、グルタミン残基がCD毒性効果に重要であることを示した。生体内の状況に応じて、小麦グルテンまたはグリアジンをペプシンおよびトリプシンのみで、またはその後にパンクレアチンで生体外消化すると、毒性が保持される。このようなCD毒性タンパク質の酵素加水分解物は、無傷のグリアジンおよびグルテンとは対照的に水または塩溶液に可溶であるため、毒性試験の陽性対照として頻繁に使用されてきた。最も引用された例は、いわゆるフレイザーのフラクションIII、小麦グルテンの消化性トリプシン（PT-）消化の水溶性部分である。グリアジン画分に相当するものとして、ライムギとオオムギのプロラミン画分はCD毒性に関連している。ただし、徹底的なテストを行うことなく、この発見に達した。 22人の患者の比較研究は、グリアジン、セカリン、およびホルデインのPT消化物が培養生検に対して同様の毒性効果を誘発することを明らかにした。ライ麦と大麦のグルテリン画分は、今日まで調査されていない。オートムギに関する矛盾した結果のため、オートムギプロラミン画分（アベニン）が分離され、in vivoチャレンジ、器官培養、およびT細胞テストによりCD毒性について広範囲にテストされた。それぞれCDおよび疱疹状皮膚炎の2人の患者は、5日間毎日2.5 gの純粋なアベニンでチャレンジされ、9日後に2.5 gでチャレンジされた。腸の生検標本と皮膚の生検サンプルのその後の検査は、アベニンの毒性効果を示さなかった。グリアジンとアベニンのPT消化物のCD固有の効果は、CDおよび非CD生検の器官培養試験で比較された。IFN-γおよびIL-2は、免疫原性応答のマーカーとして使用された。 PTグリアジン（n = 9）で培養した後、マーカーの大幅な増加が観察された。対照的に、CD生検（n = 8）がPT-aveninとともに培養された場合、反応はなかった。

別の研究では、PTグリアジン、PTセカリン、PTホルデイン、およびPTアベニンは、CD患者の5つの異なる腸T細胞株を用いた増殖アッセイを使用して比較テストされた。結果は、すべてのPT消化物に対するすべてのT細胞株の免疫反応性を示した。ただし、PTアベニンと他の消化物との間には顕著な違いがあった。TG2で処理すると、グリアジン、セサリン、およびホルデインへの応答が強化された。両方の研究の著者は、T細胞実験によって示される抗原免疫原性は毒性と同等ではないと結論付けた。これは器官培養試験またはin vivoチャレンジによって確認する必要がある。最近、3つのオートムギ栽培品種からのアベニン消化物とグリアジン消化物（陽性対照）およびオリジン消化物（陰性対照）の免疫原性が、10人のCD患者から分離された末梢血単核T細胞で測定された。 T細胞増殖とIFN-γ放出の測定により、アベニン消化物に対する異なる品種依存的な反応が高、中程度の免疫原性、または非免疫原性で示された。アベニンの免疫原性の程度の違いは、アベニン配列内の異なる免疫原性エピトープの存在に起因している。

3.4  タンパク質タイプの毒性

小麦、ライムギ、および大麦のプロラミンおよびグルテリン画分は、いくつかのタンパク質タイプで構成されている。 CD毒性に関する詳細な研究は不完全で、小麦のグリアジンとグルテニンの種類に限定されている。 Hekkensと共同研究者は、CD患者の小腸への点滴注入とその後の生検によって、明確に定義されたグリアジン亜画分A-グリアジンの毒性を最初に示した。 Aグリアジンの毒性は、器官培養試験などのin vitro試験で確認された。当時、グリアジン（糖タンパク質）に共有結合する可能性のある炭水化物は、CD毒性効果（レクチン様反応）に寄与すると疑われていた。しかし、A-グリアジンの分析は、共有結合した炭水化物が存在せず、したがってCDの活性化に関与しないことを実証した。その後のin vivoおよびin vitroの研究により、すべてのグリアジン亜画分（α-、β-、 γ-、およびω-グリアジンは、電気泳動移動度に関して）CD毒性作用を誘発した。この結果は、α-グリアジンからω-グリアジンへの毒性の減少という観点に有利だった。しかし、調査されたサブフラクションはタンパク質タイプに関して必ずしも純粋ではなく、ω-フラクションはω5-およびω1,2-タイプに区別されなかった。高度に精製されたω-グリアジン（おそらくω5-およびω1,2-グリアジンの混合物）を使用して、2人のCD患者に直腸導入を試みた。粘膜CD3 +およびγδ+リンパ球による特徴的な反応は、このグリアジンタイプに対する直腸粘膜の特異的な反応を示した。
その後、タンパク質の毒性に関する生体内および臓器培養の研究は、合成ペプチドおよびT細胞試験の利用可能性により大幅に減少した。 Molbergと同僚は、小麦粉から5つの成分（サブユニット1Ax2、1Dx5、1Bx7、1By9、および1Dy10）で構成されるHMW-GSのサブフラクションを分離し、大腸菌で発現した組換え単一サブユニット1Dx5または1Dy10を使用した。サブフラクションと単一サブユニットの両方を、HMW-GSに感受性のある一連のT細胞で、ネイティブの形で、またはTG2によって脱アミド化してテストした。結果は、CD患者22人中9人の腸T細胞が脱アミド化されたHMW-GSに応答したが、天然タンパク質には応答しなかったことを示した。生体内チャレンジおよびT細胞試験のために、小麦粉からHMW-GS（1Dx5、1Bx7、1By9、1Dy10）の混合物を分離し、沈殿とHPLCで慎重に精製した。 17人のCD患者のうち11人のT細胞株が有意に刺激された。ネイティブおよびTG2脱アミド化サブユニットへの応答の違いは有意ではなかった。 3人のCD患者にそれぞれ500 mgのサブユニットを投与し、注入を開始してから4時間後に小腸の形態が大きく変化（例えば、絨毛の高さと陰窩の深さの比）した。さらに、小腸におけるIL-15の発現は、注入の2時間後に増加した。連続して、毒性に関するインビトロ研究は、それぞれトランスジェニック酵母およびトランスジェニックトウモロコシから精製された単一の組換えHMW-GS 1Dx5および1Dy10で実施された。 CD患者13人中4人のグルテン感受性T細胞がサブユニット1Dx5に反応し、11人中3人がサブユニット1Dy10に反応した。 1人の患者の生体内チャレンジによってテストされた両方のサブユニット1Dx5と1Dy10は、陰窩の深さと腸細胞の高さに対する絨毛の高さの比に有意な変化を誘発した。 IL-15の染色の増加は、両方のサブユニットでのチャレンジの2時間後に見られた。要約すると、説明した3つの研究は、グリアジンと同様にHMW-GSがCDを悪化させる可能性があることを明確に示した。その後の研究では、未治療のCD患者がHMW-GS 1Dy10に対する抗体レベルを上昇させ、適応免疫応答におけるこのタイプのタンパク質の関与を示していることが実証された。
グリアジンおよびHMW-GSとは対照的に、LMW-GSおよび単一タンパク質タイプのライムギは、これまでCD毒性についてテストされていない。それらの潜在的な毒性は、対応するペプチドの研究から得られたものである。経口大麦チャレンジによって誘発されたホルデイン感受性T細胞を使用して、CD特異的免疫原性について異なるホルデインタイプをテストした。すべての画分は免疫原性でしたが、D-ホルデインおよびC-ホルデインが最も活性が高かった。
3.5  ペプチドの毒性
器官培養試験の導入は、少量を試験できるため、グルテンペプチド毒性に関する研究の新しい分野を開いた。それにもかかわらず、純粋なグルテンペプチドを単離し、特徴づける試みはほとんど行われていない。問題には、グルテンタンパク質画分が多数の成分で構成されており、必要な酵素消化により数百の異なるペプチドが生じるという問題があった。さらに、ペプチドの分取分離の効率は限られており、グルテンタンパク質のアミノ酸配列は1980年代まで知られてなかった。 

当時、有望な研究は、穀物のタンパク質化学を経験した研究所とCDの研究を行っている病院の協力によってのみ可能であった。
3つのパートナーグループは、総グリアジン、β-グリアジン、またはα-グリアジンのいずれかの、異なるグリアジン調製物の消化物からペプチドを分離およびテストすることに成功した。 一致して、彼らの結果は、セクションI内のα-グリアジン（α1-55）のグルタミンおよびプロリンに富む配列がCDの活性化に関与し、他の配列（α56-68、α247-266）は陰性。 活性ペプチドに共通のテトラペプチド配列PSQQおよびQQQPは、さらなる調査のための重要な配列であると考えられた。 立体配座研究により、βターンが活性ペプチドの主要な構造的特徴であることが示された。

1991年、α-グリアジンの配列を含む合成ペプチドのパネルが、小腸または腸粘膜の器官培養物への点滴注入によってテストされた。ドデカペプチドα206-217（PSQQを含む）は、in vivoで毒性効果を示した。 α-グリアジンからの3つの合成ペプチドがin vivoおよびin vitroでテストされた。一貫して、ペプチドα31-49は毒性であることが示されたが、ペプチドα3-21およびα202-220は毒性ではなかった。後者は、ペプチドα1-30、α3-24、およびα206-217と対照的である。さらに、in vivo試験では、合成ペプチドα31-43およびα44-55が毒性である一方、ペプチドα56-68は不活性であるという証拠が示された。ペプチドα31-55およびα31-43の器官培養試験では、低濃度での活性が明らかになったが、ペプチドα44-55は高濃度でのみ活性であることが判明した。単一アミノ酸残基がアラニンで置換されたペプチドα31-49の変異体は、残基L31およびP36が置換された場合、器官培養試験で活性を維持しましたが、残基P38、P39、およびP42が置換された場合、毒性を失った。寛解期の4人のCD患者は、ペプチドα56-75およびβ-カゼイン由来の陰性対照ペプチドによる挑戦を受けた。グリアジンペプチドはすべての患者で腸の損傷を引き起こしたが、カゼインペプチドは反応を誘発しなかった。グリアジンペプチドα51-70の毒性は、器官培養システムを使用して評価された。
記載されている調査がテストの数、ペプチドの純度、および結果の一致に関して部分的に不十分である場合でも、ほとんどの毒性配列はα-グリアジンのN末端ドメインで発生し、主にグルタミン、プロリン、および疎水性アミノ酸（ロイシン、フェニルアラニン、チロシン）。 γ-およびω-グリアジン、グルテニンサブユニット、セカリン、ホルデイン、およびアベニンの対応する配列は、in vivoチャレンジおよび器官培養試験によってまだテストされていない。
CD活性ペプチドの検索は、腸のグルテン感受性T細胞株とCD患者のクローンを刺激するエピトープにシフトしている。 van de Wal、Vader、Arentz-Hansen、およびShan et alのグループによって報告された免疫原性ペプチドの第1世代（1999〜2005）の小さな選択がある。腸管T細胞アッセイにより同定されたより免疫原性の高いペプチドは、Camarcaと共同研究者の論文に記載されている。小麦、ライムギ、および大麦のタンパク質の不均一性を考えると、多数のT細胞エピトープが存在することは驚くことではない。ペプチドの大部分はHLA-DQ2に制限されており、グルタミンおよびプロリンが豊富な配列ドメインに由来する。多くの研究が、患者が異なるエピトープに不均一に反応し、子供と大人の間にも違いがあることを示した。免疫原性グルテンペプチドを検出する別のアプローチは、Tye-Dinと共同研究者によって使用された。 PBMC（Peripheral blood mononuclear cell）は、3日間にわたって小麦、ライムギ、または大麦で攻撃されたCD患者から新たに分離された。
グリアジン、グルテニン、セカリン、およびホルデインに由来する合成ペプチドのライブラリをTG2で処理し、PBMCとインキュベートし、IFN-γELISpotアッセイでスクリーニングした。結果は、調査したすべてのタイプのグルテンタンパク質からの多数の免疫原性ペプチドを明らかにした。興味深いことに、T細胞を刺激したペプチドは、同じ穀物を食べた患者間で同じであった：グリアジンとグルテニンのペプチドは小麦の攻撃後のみ、セカリンのペプチドはライムギの攻撃後のみ、ホルデインのペプチドは大麦の攻撃後のみ刺激性であった。消費された穀物に関係なく、ω-グリアジンとC-ホルデインの1つの一般的なペプチド（QPFPQPEQPFPW）のみが免疫優性だった。腸のCD4 + T細胞とPBMCの両方を使用した比較研究により、2つのアプローチ間の収束を明らかにするいくつかの一般的な免疫原性配列が特定された。
米国ネブラスカ大学リンカーン大学食品科学技術部の食物アレルギー研究および資源プログラムは、CD-活性グルテンペプチドのデータベースを編集した。 60以上の出版物に記載されている1000を超えるネイティブまたは脱アミド化されたペプチドが含まれている。これらのペプチドは、すべてのタイプの小麦グリアジンとグルテニンに加えて、ライムギのセサリン、大麦のホルデイン、エンバクのアベニンにも由来している。一部の著者は、CD活性ペプチドを先天性免疫応答を生成する「毒性」ペプチドと適応免疫応答を生成する「免疫原性」ペプチドに細分した。 T細胞検査で同定された免疫原性ペプチドとin vivoまたは臓器培養検査で同定された毒性ペプチドの数の違いは異常である：1014ペプチドは免疫原性、9ペプチドは毒性、5ペプチドは毒性および免疫原性として分類されている。いずれにせよ、免疫原性が毒性に対応するかどうかの問題は回答されていない。要約すると、毒性/免疫原性ペプチドに共通する特徴は、複数のプロリンおよびグルタミン残基の存在である。これにより、4つのユニークな構造的および機能的特性が生じる：

1. これらのペプチドは、プロリン含有量が高いため、胃、膵臓、および腸の消化プロテアーゼによるタンパク質分解に対して非常に耐性がある。結果として、潜在的に免疫原性のペプチドの高い腸内濃度は、グルテンを含む食事の後に維持される。
2. これらのグルテンペプチドの選択されたグルタミン残基は、生理学的条件下でTG2によって脱アミド化またはトランスアミド化され、免疫原性の強化につながる。
3. プロリンが豊富なグルテンペプチドは、自然に左結合ポリプロリンIIらせん構造を採用する。これは、結合したすべての主要組織適合性複合体クラスIIリガンドの好ましい構造である。
4. 複数のHLA-DQ結合エピトープを含む大きなペプチドは、1つのエピトープのみを含む小さなペプチドよりも大きなT細胞刺激活性を示す。